小胶质细胞在脑梗死治疗中的研究进展

胡曼，赵虹，陈准立，朱冬雨，张瑛，李倩仪，陆征宇

1 小胶质细胞（MG）在脑梗死炎症反应中的作用

小胶质细胞（microglia，MG）是中枢神经系统（central nervous system，CNS）的主要免疫细胞，在大脑中发挥监测CNS 损伤[1]、吞噬并清除神经元碎片[2]、突触修剪[3]等功能，并为神经发生提供所必需的分泌因子[4,5]。

脑梗死发生后，大量神经元细胞因血流减少、能量耗竭而死亡，死亡或垂死的细胞释放损伤相关的配体和兴奋性毒性谷氨酸，引发炎症级联反应，加重神经元损伤[6]。在脑梗死炎症反应过程中，MG在缺血/再灌注炎性反应中起主导作用，并在脑梗死修复过程中发挥重要作用[7]。脑梗死发生后，MG激活是大脑炎症反应的第一步[8]，激活的MG可产生多种介质，包括诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）[9]、一氧化氮（nitric oxide，NO）[10]、促炎细胞因子（如TNF-α）[11]、抗炎细胞因子（如TGF-β）[12]、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神 经 营 养 蛋 白-3（neurotrophin-3，NT-3）[13]等，一方面，通过产生毒性物质而加重神经元的损伤，即M1 型（促炎表型）激活[14]；另一方面，又通过产生BDNF等生长因子促进神经元修复，即M2型（抗炎表型）激活[14]。因此，对于以MG为靶点治疗脑梗死应当尽可能使MG处于M2型，使其发挥神经保护作用，减弱炎性毒性作用。

然而，是否存在M1和M2型MG尚有争议。单细胞测序研究显示炎症反应中MG 并未产生M1 和M2两种细胞类群，仅发现部分MG在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）、肌萎缩性脊髓侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等神经退行性疾病中活化为“疾病相关小胶质细胞（disease-associated microglia，DAM）[15]。该研究发现DAM 在AD模型中位于MG区域附近，其形态和关键标记基因与MG 相似，与MG 相比，DAM 在嘌呤能受体P2ry12/P2ry13、Cx3cr1、Tmem119 等几个MG 稳态基因的表达水平降低[16,17]。DAM中还有一些基因被上调，如髓细胞触发受体2（triggering receptor expressed on myeloid cells-2，TREM-2）基因[18,19]。该研究还证实存在介于静息态MG 与DAM 之间的中间状态DAM。DAM特异性基因的基因集合富集分析显示其参与溶酶体/吞噬途径、内吞作用和调节免疫应答。但目前尚无证据证明脑梗死炎症反应中存在DAM。

血脑屏障（blood brain barrier，BBB）是一种环绕在脑血管周围的内皮细胞合胞体，保护CNS免受神经毒性物质的侵袭[20]，与神经元共同构成神经血管单元（neurovascular unit，NVU）。脑梗死发生后，神经元因功能障碍而释放过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 激活MG，产生更多的ROS，进一步放大MG 的激活，损伤内皮细胞，加剧血脑屏障的破坏，这是BBB 损伤的第一阶段[21,22]。MG中的缺氧诱导因子-1和NF-κB在脑缺血后表达上调，刺激MG产生基质金属蛋白酶，介导第二阶段的BBB 破坏[23]。缺血性脑卒中后，MG 活化可通过释放IL-1β、IL-6、TNF-α，上调星形胶质细胞中水通道蛋白-4（aquaporin-4，AQP-4）的表达，引起星形胶质细胞凋亡增强和BBB 的破坏。该研究还发现，P38信号通路参与MG介导的BBB的破坏。缺血再灌注后立即给予P38 抑制剂治疗可降低小鼠脑内AQP-4 的表达。骨髓间充质干细胞（mesenchyml stem cells，MSCs）移植可抑制MG介导的AQP-4上调和星形胶质细胞凋亡，从而维持BBB 的完整性[24]。血浆纤维蛋白原在BBB破坏后沉积在活化的MG区域，并与MG上的Mac-1相互作用，导致MG活化[25]。然而，另一项研究证明MG 在脑梗死后分泌前降蛋白，参与减少BBB的破坏和脑卒中后脑水肿，发挥保护作用[26]。因此，MG 活化与BBB 破坏之间的因果关系仍不明确。

MG焦亡也参与脑缺血性损伤[27]。在大鼠脑缺血模型中，焦亡执行蛋白（gasdermin D，GSDMD）表达升高，使该蛋白表达沉默可极大地缓解脑缺血性损伤[28]。在脑梗死中，MG 在缺血损伤后24 h 通过吞噬多形态核粒细胞发挥抗炎作用，减少神经元死亡[29]。但是在短暂脑缺血后72 h，大脑中Mac-2+常驻MG耗竭，MG通过缺血后的吞噬作用介导神经元的延迟死亡[6]。

2 通过干预MG治疗脑梗死

目前，通过干预MG 来治疗脑梗死的方法主要包括药物诱导MG向M2型极化、抑制脑梗死后MG焦亡和脑梗死恢复期的吞噬作用、干细胞移植及MG移植。

2.1 药物诱导MG M2型极化治疗脑梗死

目前用于诱导MG M2型极化治疗脑梗死的药物多数来源于实验室研究。垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase activating polypeptide，PACAP）是一种具有神经保护功能的多肽，研究者使用干细胞移植将PACAP 注入小鼠脑内，发现大脑中动脉栓塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）后3 d给予PACAP可减少脑梗死面积，促进功能恢复，并在缺血后7 d和14 d诱导MG向M2表型分化[30]。二甲双胍广泛用于治疗2型糖尿病，现已被证明能降低卒中发生率，并在体内和体外促进巨噬细胞M2 极化。MCAO 后24 h 给予二甲双胍治疗，增强MG M2极化相关基因表达，促进血管生成和神经生成，促进功能恢复；同组体外研究表明，MG 的M2极化对二甲双胍诱导的血管生成至关重要[31]。临床试验表明，人参皂苷治疗可改善急性脑梗死患者的神经功能，人参皂苷的治疗作用与抑制MG激活和减少M1表型相关的促炎细胞因子表达有关[32]。动物实验证明，慢性膳食摄入n-3多不饱和脂肪酸（n-3 PUFAs）不仅能长期保护缺血损伤，而且能积极促进神经血管动力学恢复和脑修复[33]。有研究在MCAO 后5 d 开始采用二十二碳六烯酸（DHA）腹腔注射联合饮食鱼油（FO）治疗脑梗死，结果显示，DHA和FO联合治疗能增强MG的M2型极化，促进长期的感觉运动恢复，且比单独注射DHA 更有效[34]。17β-雌二醇（17 β-estradiol，E2）具有神经保护作用。在年轻成年去卵巢大鼠脑缺血体内研究[35]中，外源性低剂量E2 严重抑制了MG 的激活，并使MG从“激活的”变形虫形态向“静止的”分枝形态转变。进一步研究M1和M2表型标记物发现，E2可显著抑制“促炎”M1表型，同时增强大鼠脑缺血后海马区M2 型MG 的“抗炎”表型。且E2 治疗消除了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的BV2-MG对海马HT-22神经元的神经毒性作用[35]。有研究在大鼠MCAO 再灌注后，每隔1 d 腹膜内注射促红细胞生成素（erythropoietin，EPO），结果显示，EPO减少了M1型MG，增加了M2 型MG，在MCAO 后第14 天，脑组织损失量显著减少，白质损伤减轻，神经行为改善[36]。此外，还有实验证明，Malibatol A（MA)[37]、银杏内酯B（Ginkgolide B，GB）[38]、金丝桃素[39]、姜黄素[40]等植物提取物，均可促进脑梗死后MG的M2 型极化。

米诺环素是一种抗炎蛋白酶抑制剂，在脑卒中模型中被证明可通过降低血脑屏障通透性、促进MG 向M2 表型的极化而发挥神经保护作用[41]。同时也在临床试验中用于治疗缺血性卒中。受试者在脑卒中症状出现后6 h内静脉注射米诺环素，预设剂量为每天3、4.5、6 或10 mg/kg，持续72 h，随访90 d，结果显示，米诺环素输液是安全的，单用或与组织纤溶酶原激活剂联合使用米诺环素均耐受性良好，最大剂量为10 mg/kg，有望用于控制脑梗死后炎症[42]。

2.2 抑制脑梗死后MG的焦亡

关于脑梗死后MG 焦亡，目前的研究主要是经典焦亡通路介导的MG 焦亡。在CNS 中，Caspase-1 主要在MG 中高度表达，Caspase-1又名IL-1β转换酶，在静息状态以无活性的酶原形式存在于细胞质，活化的Caspase-1 具有蛋白剪切功能，可将没有活性的IL-1β和IL-18 前体加工成熟[43]，还可以切割GSDMD蛋白，诱导细胞膜穿孔，促使细胞内容物释放和细胞焦亡发生[44]。在脑梗死早期即可观察到Caspase-1 主要在MG中活化，选择性抑制Caspase-1表达具有神经保护作用，可减轻脑缺血性损伤，这表明MG 经典焦亡通路极有可能介导脑缺血损伤中MG 焦亡[45]。目前已经发现的NLRP1、NLRP3、NLRP4 等炎性小体均参与调控MG中Caspase-1 活化，这可能是干预脑缺血中MG焦亡、抑制其神经毒性的关键靶点。

2.3 抑制MG在脑梗死后期的吞噬作用

在注射血管收缩剂内皮素-1（endothelin-1，ET-1）到大鼠纹状体或小鼠感觉运动皮质的脑梗死模型中，MG 在局灶性脑缺血后3～7 d 表达吞噬相关蛋白、乳脂球EGF 样因子-8（milk fat globule EGF factor 8，MFG-E8）和Mer 受体酪氨酸激酶（Mer receptor tyrosine kinase，MerTK）。MFG-E8 和MerTK 这两种蛋白的缺失可完全阻止脑缺血后运动功能缺失，并通过抑制神经元吞噬作用，显著减少脑萎缩。如果MG 在MerTK 或MFG-E8基因上存在缺陷，也可减轻脑梗死后神经损伤[6]。因此，在脑梗死早期干预MG的吞噬作用可作为脑梗死治疗的靶点。

2.4 脑梗死恢复期神经再生（干细胞移植）

干细胞移植是治疗神经退行性疾病[46]、脊髓损伤[47]、脑梗死[48,49]等多种神经系统疾病的良好策略。移植物细胞与周围环境的相互作用对神经保护作用很重要，移植的干细胞可与缺血后的脑内活化的MG相互作用并产生影响。

在大鼠短暂性脑缺血模型中，移植人神经干细胞（neural stem cell，NSCs）CTX0E03 在MCAO 后1～4 周促进纹状体MG增殖，可维持DCX+/Ki67+神经母细胞的增殖活性，且CTX0E03移植后神经细胞增殖活性的保留是在MG高增殖率的前提下进行的，这些结果提示，MG 可能部分介导CTX0E03 移植对脑梗死后神经元增殖作用[50]。移植NSCs 对缺血性脑损伤后神经功能恢复的有益作用部分是通过抗炎反应实现的，主要由脑内驻留的MG、巨噬细胞和淋巴细胞介导[51,52]。

大鼠短暂MCAO 3、7 d后，骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植抑制了MG的活化。MSCs分泌的可溶性趋化因子和IL-5 可降低MG 对LPS 刺激的反应[51]。然而，另一项研究表明，MCAO后MSCs经尾静脉移植可改善运动行为，同时伴MG激活增强[53]。移植MSCs对MG活化的争议结果可能与移植时机、剂量及实验观察时间有关。在9 d的新生小鼠缺氧缺血模型中，MSCs移植降低了MG对缺氧的反应，诱导MG极化，促进缺血脑损伤后神经功能的改善[54,55]。体外研究表明，MSCs可通过释放NO促进MG向M2型极化，影响MG活性[56,57]。

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是另一种治疗缺血性疾病的干细胞类型，卒中后循环EPCs 有短暂升高[58]，循环EPCs水平与缺血严重程度呈负相关[59]。EPCs移植可以减少脑梗死体积，改善神经功能[60-62]。EPCs 的疗效与MG 密切相关，MG和EPCs之间存在相互作用，LPS激活的MG可释放高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein 1，HMGB1），使用HMGB1 抑制剂甘草酸可阻断EPCs 移植的疗效[63]。由此可见，MG 可通过释放HMGB1 调节EPCs 旁分泌功能，增强脑梗死后EPCs移植的治疗功能。

2.5 MG移植

MG是脑内的免疫细胞，可产生多种神经营养因子，促进缺血性脑损伤后的神经恢复，有研究者尝试将外源性MG 直接移植入脑内，结果提示MG 对脑梗死有保护作用[64,65]。在短暂性MCAO大鼠模型中，脑缺血48 h后静脉注射MG有助于减少神经元凋亡，增加包括GDNF、BDNF、VEGF、BMP7 在内的神经营养因子和抗炎细胞因子IL-4、IL-15 的表达，促进神经功能恢复[50]。然而，在永久性MCAO大鼠模型中，MG经尾静脉移植并不影响神经结局[66]。结果有争议可能是因为不同的实验动物，不同的时间、路线和剂量的MG移植。除脑梗死外，有研究者在慢性缺血模型、脊髓损伤、AD、PD中也进行MG移植，都显示出MG 对组织修复和功能恢复的有益作用[67,68]。然而，MG 移植在组织损伤后影响神经功能的确切机制尚不清楚，需要进一步研究移植MG在神经系统疾病中的作用。

3 小结与展望

关于MG在脑梗死治疗中的研究目前主要集中于如何减轻缺血后炎症反应并促进神经修复及再生。研究最多的当属药物诱导脑梗死后MG向M2型极化的研究，例如二甲双胍、米诺环素等多次在动物实验中取得疗效，但目前仍存在诸多问题。首先，药物干预作用的靶点难以确定。药物干预可能会引发其他连带反应，造成无法预料的损伤。另一方面，关于MG极化过程的研究尚待明确，极化模型也存在一定的争议，目前的实验室研究尚未发现M1型和M2型MG，在脑梗死动物模型中也未发现DAM。这些问题都阻碍药物干预大量走入临床研究。多数实验均证实MG活化与BBB破坏相互促进，加重脑梗死后炎症反应，但也有证据显示MG可减轻脑梗死后BBB的破坏，因此MG活化与BBB破坏之间的因果关系仍不明确，如何调控MG来减轻脑梗死后BBB 破坏有待进一步研究。抑制脑梗死后MG 焦亡和抑制MG 在脑梗死后期吞噬作用的研究目前较少，需更多的证据支持。干细胞移植也是目前缺血性脑卒中研究的热点，其难点在于如何使移植干细胞分化为神经细胞，替代死亡的神经元的功能。MG 作为脑内最重要的免疫细胞，对干细胞移植有重要影响，阐明MG 在脑梗死后干细胞移植中的作用是研究的必经之路。MG移植则寄希望于外源性MG发挥促进神经修复的作用，探索移植MG 在神经系统中的作用机制是该研究的第一步。总之，药物干预、神经干细胞移植、MG 移植等为脑梗死治疗提供了多种治疗可能，需进一步深入研究。