运用化学遗传学方法鉴定星形胶质细胞调控抑制性突触形成的关键蛋白

苏一洵，李晖，易陈菊

星形胶质细胞（astrocyte）作为中枢神经系统（central nervous system，CNS）最主要的胶质细胞，对神经元的功能起重要支持作用。例如，星形胶质细胞可调控神经元突触形成[1-4]，并影响神经冲动传递、离子平衡以及神经递质的清除[5-9]。这些功能的结构基础之一是突触与星形胶质细胞突起所形成的三联突触（tripartite synapse）。研究发现，绝大多数神经元突触都被星形胶质细胞突起所包裹，形成三联突触[10,11]，星形胶质细胞也与神经元一起参与信息传递，对突触间的信息传递活动作出反应，并调节传递的过程[12]。

星形胶质细胞的发育与神经元突触的形成和活动是一个相互依赖的过程，但其中的作用机制仍有待探究。星形胶质细胞可通过三种不同方式促进突触生成：首先，星形胶质细胞通过分泌Thrombospondins、TGF-β、hevin 和SPARC等细胞因子，促进神经元突触生长[13-15]；其次，星形胶质细胞生成的含硫酸软骨素（chondroitin sulfate proteoglycans，CSPG）的细胞外间质可有助于突触生成[16]；最后，星形胶质细胞膜表面蛋白如Neuroligin2与Cx30可参与促进突触形成[1,17]。目前的研究主要聚焦于星形胶质细胞调控兴奋性突触形成的作用，我们对抑制性突触形成中星形胶质细胞的作用所知甚少。此外，我们对星形胶质细胞膜表面蛋白调控神经元突触形成的作用机制的了解也非常有限。这些很大程度上是由于缺乏有效的体内细胞互作的研究技术方法，因此无法对介导星形胶质细胞与神经元表面互作的功能蛋白进行系统性的鉴定，进而阻碍了对星形胶质细胞控制突触发生的过程进行更系统而深入的了解。

最近，来自杜克大学的Cagla Eroglu 团队和Scott H.Soderling团队在Nature杂志上发表的文章，为解决此问题提供了新的研究工具[18]。他们改进了在体化学遗传学BioID方法（in vivoBioID，iBioID）[19]，用以识别星形胶质细胞与神经元之间的互作蛋白。这种方法被作者命名为Split-TurboID，即利用有邻近标记功能的生物素化酶（TurboID），将TurboID 的N 端和C 端片段分别表达在星形胶质细胞和神经元膜上。在两种细胞接触表面，两个片段可重组成完整的TurboID 并获得酶活性，催化邻近蛋白的生物素化标记。因此可以认为，在此处被生物素化标记的蛋白就是星形胶质细胞与神经元接触位点中的蛋白。另外，为了鉴定其中的星形胶质细胞膜蛋白，作者还把全长TurboID 表达到星形胶质细胞膜上，生物素化标记星形胶质细胞膜蛋白。被生物素化的蛋白，将通过定量高分辨液相色谱-串联质谱（LC-MS）法进行纯化、分析。

通过这两种技术手段，作者筛选出118 个高置信度的星形胶质细胞上的三联突触相关蛋白，其中包括了神经胶质素-3（Neuroligin-3）、轴突蛋白-1（Neurexin-1）以及钙离子通道辅助亚基（CACNA2D3、CACNG2和CACNG3）；兴奋性突触蛋白（如AMPA受体：GRIA2和GRIA3）；抑制性突触蛋白（如GABAA受体）等。这些蛋白已知在三联突触结构表达，说明了该方法的可靠性。作者选出三个可能调控星形胶质细胞-神经元黏附的分子，通过体内的星形胶质细胞特异的CRISPR-Cas9 敲除实验，鉴定出神经黏附分子（neuronal cell adhesion molecule，NrCAM）是星形胶质细胞突起向神经纤维网浸润体积（neuropil infiltration volume，NIV）的负调控因子，敲除NrCAM蛋白会导致星形胶质细胞体积增大与其向神经纤维网浸润程度的增加。

作者进一步探寻NrCAM 调控星形胶质细胞形态及其对神经纤维网浸润的机制。他们在体内星形胶质细胞与神经元中表达不同标记的NrCAM，利用受激发射损耗荧光显微技术（STED）进行成像，发现星形胶质细胞与神经元的NrCAM在空间上存在共定位，证实星形胶质细胞NrCAM 与神经元NrCAM 可能通过跨细胞同源互作起作用。进一步研究发现，不管是星形胶质细胞还是神经元缺失NrCAM，抑或是两者同时缺失NrCAM，都将导致星形胶质细胞的体积增大，以及星形胶质细胞突起向神经纤维网浸润显著增加。作者再通过在星形胶质细胞中表达不同NrCAM突变体，发现神经元和星形胶质细胞通过彼此NrCAM 的细胞外免疫球蛋白区域进行互作，以维持星形胶质细胞的正常形态，限制星形胶质细胞突起向神经纤维网的浸润。

如前所述，星形胶质细胞可与神经元突触形成三联突触，并调控突触形成。因此，作者进一步研究星形胶质细胞NrCAM是否存在于三联突触中，并调控突触形成。利用STED 成像，作者发现星形胶质细胞的NrCAM 与兴奋性突触及抑制性突触在空间上非常接近，而且接近程度与已知的三联突触蛋白埃兹蛋白（Ezrin）相似，提示星形胶质细胞NrCAM 同样存在于三联突触中。当在星形胶质细胞中敲除NrCAM后，仅增加了星形胶质细胞的突起到抑制性突触的距离，并未影响星形胶质细胞突起与兴奋性突触的距离。同样的，神经元特异的NrCAM敲除也能减少星形胶质细胞与抑制性突触的互作。

作者在之前的研究中曾利用抑制性突触组织者桥尾蛋白（gephyrin）做饵，通过iBioID 识别到NrCAM 存在于GABA 能突触后膜上[20]。通过免疫共沉淀实验，作者验证了NrCAM 能与桥尾蛋白互作。由此猜测，NrCAM可能通过和桥尾蛋白形成复合体，控制抑制性突触的发生发展。为了验证这一猜想，作者在HEK 293T中过表达了人源NrCAM，并和神经元共培养，检测NrCAM是否可诱导神经元抑制性突触在293T细胞上形成。结果发现，293T 上表达NrCAM 可引导抑制性突触前膜和突触后膜的形成与特化，而敲除神经元中的NrCAM或桥尾蛋白将消除这种作用。相对应的，过表达NrCAM 不能引导兴奋性突触的形成。这一系列实验证据说明，星形胶质细胞-神经元的NrCAM 跨细胞膜的同源互作，通过神经元桥尾蛋白，促进了抑制性突触的形成与特化。

以此为基础，作者进一步在体内验证星形胶质细胞NrCAM对抑制性突触形成的作用，并发现敲除星形胶质细胞NrCAM 可显著减少抑制性突触前膜与突触后膜的共定位。这种抑制性突触的减少，可以由表达人源NrCAM 补偿。另外，敲除神经元NrCAM 同样可复现抑制性突触前膜与突触后膜的共定位减少。为了证明这种结构性的改变具有功能性意义，作者在活体脑片中进行了全细胞膜片钳实验，发现敲除星形胶质细胞NrCAM可显著降低大脑皮质2/3层锥体神经元微型抑制性突触后电流（miniature inhibitory postsynaptic currents，mIPSCs）的频率和振幅，证实在体内星形胶质细胞NrCAM是抑制性突触的形成与功能所必需。

综上所述，作者利用其研发的全新Split-TurboID工具，首次在体内实现了对不同细胞类群之间的接触性互作蛋白的标记。过往报道的突触间缝隙蛋白组学研究方法——通过HRP 耦联的轴突蛋白和神经连接蛋白在体外进行识别[21,22]，需要利用过氧化氢的标记，然而其对活体大脑正常功能和对神经纤维网中多细胞互作的过程都具有相当大的毒性，因此难以在体内实现。而Split-TurboID 恰好克服了这个难点，因而能运用到体内进行不同细胞类型连接的蛋白组学研究。作者将其应用于星形胶质细胞与神经元之间互作的研究，鉴定出118 个潜在的星形胶质细胞与神经元表面互作蛋白，其中包括NrCAM这一神经黏附蛋白。并发现星形胶质细胞NrCAM 通过与神经元NrCAM 的跨细胞膜同源互作，负调控星形胶质细胞的体积与其对神经纤维网的浸润，并通过抑制性突触后膜组织者桥尾蛋白，促进抑制性突触的形成和功能。

Cagla Eroglu 实验室此前发现星形胶质细胞膜上的Neuroligin2也可调控星形胶质细胞的体积大小以及突触形成[18]。然而，与NrCAM 不同的是，Neuroligin2促进了星形胶质细胞体积扩增与其对神经纤维网的浸润，同时只对兴奋性突触形成有促进作用，而对抑制性突触没有显著作用。另一方面，与NrCAM 相似，星形胶质细胞膜上的连接蛋白Cx30 同样也是三联突触中的关键蛋白，参与负调控星形胶质细胞突起向神经纤维网的浸润[23]，并抑制兴奋性突触中信号传递。Cx30在发育过程中则可通过下游RhoA-ROCK通路，抑制微环境中MMP9的表达，从而促进抑制性突触的形成[16]。这些研究共同揭示了三联突触中星形胶质细胞调控突触形成与功能的机制，同时也提出了一个有趣的问题：星形胶质细胞形态调控与其对兴奋性或抑制性突触的不同调控是否存在功能上的偶联？

另外值得注意的是，Split-TurboID 鉴定出的三联突触相关蛋白中，还包括了连接蛋白家族成员Gjc3（Cx29）。连接蛋白可在细胞之间形成缝隙连接通道，介导细胞间的信号与物质交流，也可作为半通道，介导细胞内与胞外基质的物质交流。鉴于Split-TurID技术的高置信度，结合Cx30在调控星形胶质细胞形态与突触发生的功能，Cx29可能也是三联突触的重要功能蛋白，其在调控突触形成中的潜在关键作用有待进一步研究。