靶向细胞凋亡的纳米探针在MRI中的应用

谭昕玥，郑元元

(首都医科大学 a.基础医学院2019级儿科学“5+3”一体化，b.药学院药理学系，北京 100069)

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主有序的死亡过程，在个体生长、发育、变异等方面起重要作用，若细胞凋亡过程出现异常，将会导致多种疾病，如肿瘤[1]、神经退行性病变[2]、自身免疫性疾病[3]以及获得性免疫缺陷综合征[4]。利用靶向细胞凋亡的纳米探针可直观地进行细胞凋亡的分子显像。目前用于细胞凋亡分子成像的影像学技术主要集中于核医学、光学或磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)等。MRI作为现代医学影像手段之一，在多种疾病诊断中有非常重要且广泛的应用。与MRI相比，核医学的空间分辨力低，且具有电离辐射；MRI不受限于成像深度，且具有优异的软组织对比度等优点[5]，但MRI的目标灵敏度仍存在不足。因此，为了增强图像对比度、缩短成像时间，MRI对比剂被广泛应用[6]。在大量涌现的新型MRI对比剂中，纳米探针具有高信号、多模态、无毒的特点[7]，相关研究正在不断深入发展。目前，应用于MRI的细胞凋亡纳米探针主要有靶向细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)的探针和检测胱天蛋白酶(caspase)活性的探针，现对上述两类靶向细胞凋亡的纳米探针在MRI中的应用予以综述。

1 细胞膜上外翻的PS

PS外翻是早期细胞凋亡检测的生化基础之一。正常情况下，细胞膜的固有磷脂成分PS只分布于细胞膜脂质双分子层的内层，当发生细胞凋亡时，PS由内层迁移到外层[8]。

1.1膜联蛋白V(Annexin V)相关纳米探针 Annexin V是一种人体内源性蛋白，属于钙离子依赖性磷脂结合蛋白家族，其分子量为36 000。Annexin V能特异性识别暴露在细胞膜脂质双分子层外层的PS，并以较高的亲和力结合，是一种检测细胞凋亡的常用试剂[9]。目前，Annexin V相关探针主要包括Annexin V-交联氧化铁(crosslinked iron oxide，CLIO)、Annexin V-超顺磁性氧化铁(small particle of iron oxide，SPIO)、Annexin V-非常小的氧化铁颗粒(very small iron oxide particles，VSOP)、Annexin V-超小型超顺磁性氧化铁(ultrasmall particle of iron oxide，USPIO)。

1.1.1Annexin V-CLIO Annexin V与CLIO纳米颗粒(nanoparticles，NPs)偶联得到Annexin V-CLIO，其平均包含2.7个Annexin V，每个CLIO之间通过二硫键连接。Schellenberger等[10]通过喜树碱诱导细胞凋亡，将Jurkat T细胞(健康的69%和凋亡的31%)的混合物与Annexin V-CLIO共同孵育，同时设置未经处理的对照组。MRI实验表明，在最低测试浓度下，喜树碱处理的凋亡细胞的磁共振信号较未处理细胞明显减弱，而未经CLIO修饰NPs则无法使凋亡细胞发生明显的信号变化。Annexin V与CLIO的连接为检测凋亡MRI探针的开发提供了一种策略。

Annexin V-CLIO联合近红外荧光分子Cy5.5形成多模态靶向探针Annexin V-CLIO-Cy5.5，与Annexin V-CLIO相比，Annexin V-CLIO-Cy5.5具有磁性对比功能，且能产生荧光，可提供更多的信息。Sosnovik等[11]通过短暂性结扎小鼠冠状动脉左前降支制备心肌缺血性损伤动物模型，对给予Annexin V-CLIO-Cy5.5(2 mg Fe/kg)的5只小鼠和给予相同剂量CLIO-Cy5.5(2 mg Fe/kg)的4只小鼠的心脏进行MRI，结果显示，Annexin V-CLIO-Cy5.5组小鼠心脏缺血部位的磁共振信号明显减弱，表明存在Fe沉积，提示Annexin V-CLIO-Cy5.5与凋亡心肌细胞膜上的PS直接特异性结合；之后进行的离体荧光成像也确认了MRI检测心肌细胞凋亡的准确性。需要注意的是，Annexin V-CLIO-Cy5.5对PS具有高亲和力，故可使用较低剂量的Fe纳米探针，从而最大限度地降低探针的非特异性摄取能力，证实了使用Annexin V-CLIO-Cy5.5获得体内高分辨率心肌细胞凋亡MRI的可行性，提示Annexin V-CLIO-Cy5.5可能成为心血管成像及诊断相关疾病的重要工具，且有助于开发常见心血管疾病的新的心脏保护策略。

1.1.2Annexin V-SPIO SPIO是一种新型静脉MRI T2加权造影剂，常用于伴有网状内皮系统改变的肝脏病变的诊断。体外重组纯化的Annexin V蛋白的胺基与SPIO羟基共价连接即可得到Annexin V-SPIO。

Annexin V-SPIO可与凋亡细胞膜特异性结合。Dash等[12]用吡柔比星分别诱导了新生大鼠心室肌细胞、心脏成纤维细胞、间充质干细胞以及在体小鼠心脏的细胞凋亡，并使用T2加权3 T MRI进行检测，结果显示，随着细胞凋亡的发生，出现Annexin V-SPIO弥漫性心肌T2信号损耗，可反映铁含量和capase酶活性，与细胞凋亡标志物高度相关。以上结果证实，利用Annexin V-SPIO的MRI可检测早期非缺血性心脏细胞凋亡，以早期识别患者可逆性受损心脏细胞，这对心脏疾病的治疗有重要意义，但其能否临床应用尚待明确。目前，以70 kg的患者为例，通常Annexin V-SPIO的使用剂量约为SPIO 100 mg和Annexin V 200 mg，而人体血浆Annexin V蛋白水平为2～15 μg/L，因此目前Annexin V-SPIO的使用剂量似乎不大合理。Annexin V-SPIO是一种可用于检测体内早期细胞凋亡的MRI探针，可能为心血管疾病的基本机制及新的诊断和治疗策略提供借鉴，未来还需要研究Annexin V-SPIO在其他损伤模型中检测动态细胞凋亡和治疗的能力。

1.1.3Annexin V-VSOP Annexin V-SPIO可以反映细胞凋亡的情况，但其纳米探针较大，需要较长时间才能在体内达到合适的信噪比。Figge等[13]通过带正电荷的鱼精蛋白肽将Annexin V静电耦合到VSOP表面合成了Annexin V-VSOP超小磁NPs，其直径只有(14.4±2.3) nm，且具有较高的T2弛豫率。与现有MRI探针相比，Annexin V-VSOP为其在目标组织中的良好生物相容性和生物利用度提供了先决条件。使用Jurkat T细胞在体外对Annexin V-VSOP探针的特异性结合进行分析，在RPMI培养基中向Jurkat T细胞加入喜树碱诱导细胞凋亡，用Annexin V-异硫氰酸荧光素流式细胞术定量凋亡细胞百分比。将喜树碱处理和未处理的Jurkat T细胞与Annexin V-VSOP和非结合Annexin V的M1234-VSOP共同孵育，结果显示，与Annexin V-VSOP共同孵育的未经喜树碱处理的Jurkat细胞(6%凋亡)相比，与Annexin V-VSOP共同孵育的经喜树碱处理的Jurkat T细胞(14%凋亡)的T2加权MRI信号减少较明显，表明Annexin V-VSOP与具有较高PS暴露量的细胞的结合率更高，即体外细胞实验显示其与凋亡细胞的结合有较好的特异性。

1.1.4Annexin V-USPIO 依据水合粒径的不同，磁性氧化铁NPs造影剂通常被粗略地分为SPIO和USPIO。一般认为，SPIO的水合粒径>40 nm，USPIO的水合粒径<30～40 nm[14]。USPIO易逃避网状内皮系统的摄取，故其血液循环时间较SPIO更长，更适用于肿瘤的转移成像和动脉粥样硬化检测。

针对动脉粥样硬化检测，Burtea等[15]研究显示，由USPIO与一种线状六肽交联形成的USPIO-R826可识别并结合PS。给予敲除载脂蛋白E基因小鼠注射0.1 mmol Fe/kg USPIO衍生物，通过4.7 T核磁共振光谱仪成像，在造影剂给药24 h后，采集主动脉样本进行组织化学检查，结果显示，在腹主动脉粥样硬化斑块处USPIO-R826表现出高摄取，证实凋亡细胞靶向的USPIO衍生物是非常有前景的检测动脉粥样硬化斑块的工具，有助于检测脆弱斑块，具有成像时间短、剂量低的优点。

Nishie等[16]对Annexin V-USPIO在体内外检测药物诱导细胞凋亡的潜力进行探讨，在体外实验中，设置与Annexin V-USPIO共同孵育组和对照组，当喜树碱诱导的凋亡细胞在体外浓度为0.089 mmol Fe/L时，用0.47 T核磁共振光谱仪测量两组细胞悬浮液的T2值，结果显示，与Annexin V-USPIO共同孵育的含凋亡细胞悬液的T2弛缓时间为286 ms，而对照组的T2弛缓时间为620 ms；在体内实验中，对腹腔注射依托泊苷和环磷酰胺2 h带瘤小鼠行1.5 T核磁共振扫描，并与静脉注射Annexin V-USPIO(100 μmol Fe/kg)后的2、4、6和24 h的核磁共振扫描结果进行比较，通过数据分析证实，新开发的Annexin V-USPIO在体内外均具有检测药物诱发的凋亡细胞的能力。

1.2突触结合蛋白C2域 突触结合蛋白C2域以钙依赖的方式与PS结合，其分子量较小，约为1 470[17]。将大肠埃希菌中纯化的突触结合蛋白C2域与谷胱甘肽硫转移酶(glutathione S-transferase，GST)融合，并将其与异硫氰酸荧光素结合，然后通过流式细胞仪和共聚焦显微镜检测其能否识别由依托泊苷(DNA拓扑异构酶Ⅱ抑制剂)诱导的大鼠淋巴瘤EL4细胞的早期凋亡，结果显示一些C2阳性细胞的大小和粒度尚未发生变化，表明突触结合蛋白C2域能够在细胞发生形态变化的早期检测到凋亡现象[18]。

C2-SPIO是突触蛋白Ⅰ的C2域与SPIO交联后形成的复合分子。为了证明C2-SPIO与凋亡细胞可以在体内结合，对经过依托泊苷和环磷酰胺联合化疗48 h的C57BL/6荷瘤小鼠(已植入EL4细胞并形成肿瘤)静脉注射C2-SPIO和牛血清蛋白-SPIO，Zhao等[18]以牛血清白蛋白-SPIO处理的荷瘤小鼠作为对照组发现，仅依托泊苷和环磷酰胺联合化疗组小鼠肿瘤部位T2信号出现明显变化，而牛血清白蛋白-SPIO组则没有信号变化，表明C2-SPIO可特异性地识别体内的凋亡细胞。C2-SPIO对MRI检测非常敏感，但其仍存在局限性：①相对粒径较大(约30 nm)，较难从血管外进入肿瘤间质，从而降低了组织对比度。②与突触结合蛋白C2域结合后导致信号强度降低，故在肿瘤中难以检测到。

Krishnan等[19]将钆(Gadolinium,Gd3+)螯合物和荧光探针连接到GST-C2A融合蛋白的赖氨酸ε-氨基上，利用其表面等离子体共振表征与PS的结合，通过流式细胞仪和MRI进一步观测其与体外肿瘤细胞的结合情况，结果显示，分子量相对较小(约为100 000)的Gd3+造影剂在MRI图像上显示出正对比度，故可用于检测肿瘤细胞的凋亡。

以往研究发现，MRI造影剂附着在突触蛋白的C2A结构域表面赖氨酸残基的ε-氨基基团上[20]。在C2A和C2A-GST融合蛋白中分别有14、35个赖氨酸残基。因此，MRI造影剂与C2A-GST融合蛋白连接将产生多种物质，可能会减少C2A-GST融合蛋白与PS结合的特异性。

由于C2A结构域中没有其他半胱氨酸残基，Alam等[21]用单一的半胱氨酸残基取代C2A结构域第78位丝氨酸残基，记为C2Am，这为用荧光、放射性核素或MRI检测标签修饰蛋白提供了一个独特的位点。此外，比较C2Am-GST与Annexin V两种探针的体外实验表明，与用相同荧光团标记的Annexin V商业制剂相比，C2Am对凋亡和坏死细胞的标记更少，其与活细胞的结合也更弱，因此其与凋亡和坏死细胞的特异性结合提高了4倍[21]。C2Am为开发临床检测肿瘤细胞凋亡的更具特异性的新一代成像探针提供了方向。

1.3多肽E3 利用噬菌体展示技术可以分离出对给定目标具有亲和力的肽。Laumonier等[22]使用与M13噬菌体的pⅢ次要衣壳蛋白融合的六肽随机肽库，在灌流小鼠肝脏的体外实验中，选择了对凋亡结构具有亲和力的肽，对所选肽体外的PS结合能力进行评估，结果显示E3噬菌体具有明显的亲和力，这是首次将体外噬菌体展示技术用于选择凋亡特异性肽，丰富了分子成像造影剂的研发。

Segers等[23]将USPIO共价偶联到噬菌体壁的蛋白质上，采用酶联免疫吸附试验进行研究，结果表明，与PS孵育的E3磁噬菌体保留了非磁性标记噬菌体的性质，但体内实验发现，噬菌体的磁性会在血流中被迅速清除，并被肝脏的吞噬细胞内化，为了避免上述情况发生，USPIO被聚乙二醇化后形成隐蔽的E3-聚乙二醇-噬菌体，且可成功靶向于凋亡的肝脏部位。

Chilla等[24]制备的DO2AGAPNBn是一种具有两种不同臂的DOTA[DOTA类配体包裹在镧系(Ⅲ)离子周围，产生两种配位几何构型，即方形反棱镜和扭曲方形反棱镜]，结果显示，对硝基苄基膦酸和戊二酸臂可使扭曲方形反棱镜配位水分子交换速率提高10～100倍。地塞米松诱导的胸腺皮质凋亡小鼠模型的体内实验表明，E3六肽与Gd-DO2AGAPNBn结合可靶向胸腺细胞暴露的PS，且MRI显示的信号强度发生明显变化[24]。

1.4Zn2+-二甲基吡啶胺(dipicolylamine,DPA) Zn2+-DPA复合物(又称PSS-380)是由两个二价金属阳离子通过PSS-380的有机支架同时配位形成的复合物，功能类似于Annexin V结构域的Ca2+结合位点(负责膜结合和PS识别)[25]。两种Zn2+的空间分离使PSS-380能够与PS官能团中的羧酸盐和磷酸盐阴离子相互作用，通过PSS-380染色可有效识别凋亡细胞。

Zhao等[26]通过菌株促进的点击化学反应，成功开发了ZnDPA结合的Fe@Fe3O4NPs，这是一种基于锌(Ⅱ)二苯胺(ZnDPA)缀合的Fe@Fe3O4NPs(MNPs/ZnDPA)的凋亡归巢纳米平台。为了评估MNPs/ZnDPA靶向凋亡的能力，陶诚等[27]通过0.5 T磁共振(magnetic resonance,MR)系统测量由抗癌药物多柔比星诱导的与MNPs/ZnDPA共同孵育2 h的正常和凋亡细胞的T2值，结果显示，凋亡细胞的ΔT2/T2值高于正常细胞。为了进一步验证MNPs/ZnDPA凋亡靶向能力，在MNPs表面上标记异硫氰酸荧光素，孵育后可见明显的绿色荧光信号[27]。由此可见，MNPs/ZnDPA对凋亡细胞具有良好的靶向性质，该纳米平台可能是提高NPs的靶向效率以及增强肿瘤靶向性的一种新策略。

2 caspase

哺乳动物细胞中的caspase家族至少有16名成员，其在细胞凋亡的调节和执行中起关键作用[28]。但不是所有caspase都参与细胞凋亡过程，其中caspase-3/7/8被认为是各种因素导致凋亡的关键酶。capase-3和capase-7为凋亡执行者，caspase-8为启动者[29]。caspase-3对底物蛋白切割识别序列为DEVD(Asp-Glu-Val-Asp，天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸)。caspase-3/7已成为评估促凋亡抗肿瘤治疗的重要早期生物标志物，因此体内无创检测caspase-3/7活性可为肿瘤治疗的疗效和抗肿瘤药物的选择提供宝贵的预测信息。虽然已经开发了许多caspase-3/7靶向荧光和正电子发射断层成像探针，但仍缺乏基于Gd的能够在体内以高空间分辨率检测caspase-3/7活性的MRI探针。Ye等[30]采用自组装的方法开发了基于Gd的可激活caspase-3/7的MRI探针C-SNAM。C-SNAM由提高生物相容性的2-氰基-6-羟基喹啉和D-半胱氨酸残基、可被活性capase-3/7识别的DEVD肽、可被细胞内谷胱甘肽还原的二硫键以及Gd-DOTA构建而成。在凋亡的肿瘤细胞中，C-SNAM触发并自组装成NPs，并通过纳米聚集有效放大分子水平的变化，增强自旋晶格弛豫性，约使用目前1/10剂量的临床造影剂即可准确地测量肿瘤对化疗或放疗的反应，并可延长探针在肿瘤组织内的滞留时间，提高信噪比。

C-SNAM还可用于关节炎关节干细胞凋亡的成像。基质相关干细胞移植物(matrix associated stem cell implants，MASI)是修复软骨缺损的一种很有前途的材料[31]。然而，MASI的生存时间有限，限制了软骨再生以及关节功能重建。Nejadnik等[32]报道，通过caspase-3水解，C-SNAM自组装成NPs，可使1H-MR信号扩增90%，且其体内滞留时间明显延长。关节内注射后，与正常MASI相比，凋亡MASI中的C-SNAM可引起明显的MR信号增强。可见，C-SNAM可应用于广泛的细胞移植。

与传统1H-MRI相比，19F-MRI的灵敏度是1H-MRI的82%，但19F的自然界丰度为100%，且由于体内几乎无氟元素存在，所以19F-MRI是一种无背景干扰、特异性极高的成像方法[33]。但由于19F-MRI的信号强度较低，很少将19F-MRI探针用于活体动物酶活性的观察。

Akazawa等[34]开发了一种独特的由全氟碳液态核心和坚固的二氧化硅外壳组成的NPs，称为“FLAMES”，且其在体内具有较高的敏感性。基于FLAMES研制的纳米探针FLAMES-DEVD 2，带有一个19F-MRI开关，用于检测caspase-3/7活性。为了提高caspase-3对多肽的裂解效率，学者设计了一种新的Gd3+复合偶联肽DEVD X (X=1,2)，这是一个连续重复X次的底物肽序列，且DEVD 2较DEVD 1具有更快的裂解动力学。FLAME-DEVD 2对caspase-3活性的响应表明其具有高19F-MRI信号增强率。在静脉注射FLAME-DEVD 2和促凋亡试剂后，利用19F-MRI成功地对鼠脾脏caspase-3/7进行了活体成像，该成像平台显示了巨大的潜力，可实现体内酶活性的高灵敏度检测。

Wang等[35]研制了一种双功能化酶活化的19F-NMR/MRI探针Cys(StBu)-Asp-Glu-Val-Asp-Lys(FMBA)-CBT(Cy-CBT)，当该探针进入细胞内时，通过控制胞内谷胱甘肽，CBT与Cys点击缩合反应而自组装成NPs，在天冬酰胺内肽酶的作用下，caspase-3/7裂解为DEVD，从而实现对该凋亡部位的MRI。

此外，Li等[36]通过创建FL(fluorescence)-MR生物响应探针CP1(caspase probe 1)进行双峰成像。CP1由DOTA-Gd(Ⅲ)螯合物、作为聚集诱导发光体(aggregation induced emission luminogens，AIEgen)的四苯乙烯、作为caspase-3/7底物的DEVD肽三部分组成。在不存在caspase-3/7的情况下，CP1保持水溶性和单体状态，表现低FL-MR信号；在响应caspase-3/7时，DEVD被裂解，剩余的Gd(Ⅲ)-AIEgen结合聚集导致FL-MR信号增加。在体外实验中，该探针表现出无毒性、动力学更高等特点，而利用CP1的FL响应还能够量化非活性和活性药物的确切浓度，并在体外准确预测MR信号，使体内MRI结果的体外验证成为可能。CP1可用于细胞凋亡的实时监测，并为评估癌症治疗反应和筛选临床前抗癌药物提供了宝贵信息。

3 小 结

细胞凋亡成像的关键是选择合适的探针，即具有生物相容性高、毒性小、特异性高等特点的探针。随着医学技术的不断发展，个性化、精准性成为MRI探针分子的研究方向。针对不同的疾病、细胞、组织或器官，特异性探针具有独特的优势，而缀合物在其中发挥了巨大作用，如通过改进材料设计、加入金属离子(基于MNPs/ZnDPA的凋亡归巢纳米平台)、引入荧光标记(Annexin V CLIO-Cy5.5)等合成新型MRI纳米探针；此外，新型造影剂也推动了MRI纳米探针的发展，如较传统T1和T2对比剂具有更高敏感性和特异性的CEST(chemical exchange saturation transfer)对比剂的出现[37]。Chan等[38]利用具有CEST效应的赖氨酸构建的脂质微囊通过检测pH值判断干细胞移植后的凋亡情况。目前，智能型MRI造影剂(如C-SNAM)已成为新的研究热点，该类造影剂不仅提高了检测灵敏度,还能够针对病变信号分子进行分子成像[39]。实际应用中，除需要克服MRI低灵敏度的缺点外，MR信号量化成为亟待解决的主要问题，使用双峰剂(如FL-MR)生物响应探针CP1即通过灵敏度更高的成像方式量化MRI造影剂的浓度，以很好地解决上述问题。随着对细胞凋亡机制更深入的了解与研究、MRI技术的不断完善，更多靶向细胞凋亡的纳米探针将被开发并在临床诊疗中发挥巨大功效。