气相色谱-质谱指纹图谱结合化学计量学方法分析不同产地艾叶挥发油的差异

赵永恒 ,张 勇 ,秦志旺 ,董 阳 ,汤哲伟 ,陈富超 ,罗 雪,郝新才∗

(1.湖北医药学院 药学院 武当特色中药研究湖北省重点实验室 湖北省药用植物综合利用工程技术研究中心,十堰 442000;2.十堰市惠文药业有限公司,十堰 442000;3.湖北医药学院 附属东风医院 药学部,十堰 442008)

艾叶为菊科植物艾Artemisia argyiLevl.et Vant.的干燥叶[1],含有挥发油类[2]、黄酮类[3-4]、酚酸类[5-6]、多糖类[7]及矿物元素[8]等多种天然化学成分。艾叶挥发油是艾叶的主要功效成分,具有抗炎[9-10]、抗 病 原 微 生 物[11-12]、抗 氧 化[13-14]、抗 肿瘤[15-16]等作用,是衡量艾叶质量的重要指标。挥发油的检测方法主要有高效液相色谱法[17]、气相色谱法[18]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[19]等。GC-MS可在无标准品的情况下,实现被测样品组分的定性、定量分析,多用于艾叶挥发油的鉴别[20],但采用该方法进行产地差异分析的研究较少。鉴于此,本工作以湖北、安徽、山东、河南等地区的艾叶样品为研究对象,采用GC-MS指纹图谱和主成分分析(PCA)、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)及系统聚类分析等化学计量学方法,对不同产地的样品进行分类,以期为艾叶挥发油的资源开发及利用提供依据。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

GCMS-TQ 8050型气相色谱-三重四极杆质谱联用仪,配NIST14 系列标准谱图库;SQP 型电子天平;ZNHW 型调温电热套。

正己烷为色谱纯;氯化钠、无水硫酸钠为分析纯;试验用水为蒸馏水。

试验所用10 批艾叶购自湖北、湖南、河南、山东、安徽等主产地,具体来源信息见表1。经湖北医药学院中药学教研室邓雪华副教授鉴定为菊科植物艾Artemisia ArgyiLevl.et Vant.的干燥叶。

表1 艾叶样品来源信息Tab.1 Source information of Folium Artemisiae argyi samples

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Sh-Rtx-5Sil MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);载气为高纯氦气;进样口温度220 ℃;进样量1μL;流量3 mL·min－1;分流进样,分流比30∶1。柱升温程序:初始温度为50 ℃;以4 ℃·min－1速率升温至110 ℃;再以10 ℃·min－1速率升温至230 ℃,保持7 min。

1.2.2 质谱条件

电子轰击离子源;电离能量70 eV;离子源温度230 ℃;四极杆温度150℃;溶剂延迟时间3 min;质谱扫描范围 质荷比(m/z)40～550。

1.3 试验方法

参照《中华人民共和国药典》(2020年版)附录XD 挥发油测定法中的甲法进行提取。将来自不同产地的样品粉碎、过三号筛(355μm±13μm)。称取40 g 样品,置于1 000 mL 圆底烧瓶中,加入700 mL水,连接挥发油测定器和冷凝管。饱和氯化钠溶液100 mL 由冷凝器上端加载至烧瓶中,于100 ℃加热回流5 h,直至提取器中上层挥发油量不再发生变化。关闭电源,放置10 h,分取0.1 mL,用正己烷稀释至10 mL,摇匀后加入1.0 g无水硫酸钠,过0.22μm 滤膜,滤液供GC-MS分析。

2 结果与讨论

2.1 艾叶挥发油的得率

按照试验方法分析10批艾叶,挥发油的得率见表2。

表2 10批艾叶挥发油的得率Tab.2 Yield of volatile oil in the 10 batches of Folium Artemisiae argyi

2.2 艾叶挥发油GC-MS指纹图谱及相似度分析

10批艾叶挥发油的GC-MS指纹图谱见图1。

图1 艾叶挥发油的GC-MS指纹图谱Fig.1 GC-MS fingerprint chromatograms of volatile oil in Folium Artemisiae argyi

经NIST 谱库检索,在10批艾叶挥发油中共检出103种成分,其中共有成分有21种。采用峰面积归一化法确定挥发油各共有成分的相对含量,将实际得到的成分信息与谱库进行比对,得到其相似度值,结果见表3。

表3 共有成分信息Tab.3 Information of the common components

将10批艾叶挥发油的总离子流色谱图导入指纹图谱相似度评价系统,以S8的GC-MS指纹图谱为参照图谱,以信号强度较大的桉油精色谱峰为参照峰进行多点校正,计算各图谱的整体相似度,结果见表4。

表4 10批艾叶挥发油GC-MS指纹图谱的相似度结果Tab.4 Results of similarity of GC-MS fingerprint chromatograms of volatile oil in the 10 batches of Folium Artemisiae argyi

由表4可知,除S5(湖北省随州市)、S6(安徽省亳州市)样品的相似度(0.716,0.693)较低外,其他产地样品的相似度均不小于0.916,整体相似度较高,故可以将S1、S2、S3、S4、S7、S8、S9、S10样品聚为一类,S5、S6样品分别聚为一类。

2.3 化学计量学分析

2.3.1 主成分分析与偏最小二乘法-判别分析

运用SIMCA-P 14.1 软件中的PCA 和PLSDA 对10批艾叶挥发油的GC-MS共有峰信息进行分析,相应的得分图见图2。

图2 10批艾叶挥发油共有峰的PCA 和PLS-DA 得分图Fig.2 Score charts of PCA and PLS-DA of the common peaks of volatile oil in the 10 batches of Folium Artemisiae argyi

结果显示:S5、S6样品较离散,分别聚为一类,剩下8批样品聚类一类,这与前述相似度分析结果一致,且PLS-DA 的聚类效果优于PCA。选取5个主成分,PLS-DA 的累计模型解释度为99.2%,累计模型预测能力为65.7%,说明PLS-DA 的分类结果具有可靠性。

对21个共有峰进行变量重要性投影(VIP)分析,结果见图3。

图3 21个共有峰的VIP值Fig.3 VIP values of the 21 common peaks

由图3可知,1α,4β-二甲基-7β-异丙烯基-十氢萘酚(18)、α-松油醇(9)、4-萜烯醇(8)、龙脑(7)、蒿酮(4)、桉油精(3)、10,10-二甲基-2,6 亚甲基二环[7.2.0]十一烷-5-醇(16)、植酮(20)、樟脑(6)和植物醇(21)等10 个共有峰的VIP 值大于1,说明这10种成分对不同产地艾叶挥发油的质量差异影响较大。

运用置换检验评价模型的有效性,累积解释率(R2)回归线用于评价模型是否可靠,R2回归线在y轴的截距一般大于0.5;累积预测率(Q2)回归线用于评价模型的拟合程度,Q2回归线在y轴的截距为负值时,表明模型没有过拟合现象[21]。对21个共有峰的PLS-DA 模型进行200次置换检验,结果显示,R2回归线截距为0.657,Q2回归线截距为－0.154,PLS-DA 模型可靠,且拟合有效,说明10批艾叶挥发油质量是有差异的。

2.3.2 系统聚类分析

运用SPSS 20.0软件中的组间均联法,采用平方欧式距离对10批样品进行系统聚类分析,结果见图4。

图4 10批样品的系统聚类分析树状图Fig.4 Dendrogram of hierarchial-cluster analysis of the 10 batches of samples

由图4可知,当平方欧式距离为15时,10批样品可聚为3 类,其中S1、S2、S3、S4、S7、S8、S9、S10样品聚为一类,S5、S6样品分别聚为一类,和PLSDA 以及相似度分析所得聚类结果一致,说明3种分类方法均能反映不同产地艾叶挥发油成分的差异,而产生差异的原因可能与药材的生长环境(如土壤、气候)及加工贮藏方式等有关。

本工作采用《中华人民共和国药典》(2020 年版)中的挥发油提取方法提取了10批不同产地艾叶中的挥发油,利用GC-MS建立艾叶挥发油的指纹图谱,共鉴定出103个成分,其中共有成分有21个;分别采用相似度分析、PCA、PLS-DA 和系统聚类分析对样品进行分类,发现可将收集的艾叶分为3类,研究结果有望为艾叶挥发油的医疗研究等提供技术参考。