宏基因组学第二代测序技术对比传统微生物培养在慢性子宫内膜炎病原学诊断中的优势

刘海瑛 谭国英 李爱平

（青岛市妇女儿童医院生殖中心，青岛市黄岛区中医院，山东 青岛 266000）

慢性子宫内膜炎一般无经典的临床症状，多是 由急性炎症转变而来，是由于各种原因引起的子宫内膜结构发生炎症性的改变，细菌可通过阴道上行至宫颈，造成子宫内膜、输卵管的感染[1]。有文献显示，慢性子宫内膜炎是造成女性不孕不育的主要原因之一[2-3]。在辅助生殖技术的研究中，发现慢性子宫内膜炎会影响患者的胚胎着床率、胚胎发育率，且易造成复发性流产、着床反复失败。Puente等[4]研究显示，与健康人群相比，罹患子宫内膜炎的患者流产率、胚胎着床率都较高。慢性子宫内膜炎的主要病理特征是：子宫内膜间质的浆细胞浸润，因此，子宫内膜微生物检测能为慢性子宫内膜炎患者的诊断、治疗提供可靠的临床信息。目前，子宫内膜微生物检测方法仍以传统的微生物培养法为主，但该方法对技术要求高、耗时长，且多数微生物无法通过培养法来鉴定，因此，在临床的应用中受限。而非培养的新型诊断技术——宏基因组学第二代测序技术（metagenomic next generation sequencing，mNGS）迅速发展起来，在病原学诊断方面具有独特的优势，具有检测时间短、操作简便、检测准确率高等优点[5-6]。本研究采用mNGS法来检测慢性子宫内膜炎患者的病原体，并与传统微生物培养法相比较，评价mNGS法在慢性子宫内膜炎病原学诊断中的优势。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年1月至2021年12月我院生殖中心病理及宫腔镜检查初步诊断为CE的不孕不育患者500例，患者年龄23～40岁，平均（31.38±4.79）岁。纳入标准：①患者年龄大于18岁，临床病理证实为慢性子宫内膜炎。②对同一位置的标本同时进行微生物培养法与mNGS的检测。③子宫内膜标本采集前1个月内均不曾使用任何抗生素。排除标本在取样、转运、处理过程中受到污染者。同时取子宫内膜标本送检，每份标本均分为2份，1份行传统微生物培养法检测病原体，另1份行mNGS法检测病原体。所有患者知情、同意并签署相关文件，本研究已获得我院伦理委员会的批准。

1.2 标本采集

1.2.1 宫腔镜检查时子宫内膜活组织取样 女性在月经期干净后，完善检查无阴道炎、无手术禁忌证，术前清洗外阴，消毒阴道、宫颈，放置内窥器，再次碘伏消毒宫颈口、阴道侧壁，生理盐水擦洗宫颈口，进镜镜下对子宫内膜充血、微小息肉等可疑感染组织活检钳取样，一份密封送病原体培养，一份基因测序标本置细胞保存液，2～8 ℃保存送至实验室。

1.2.2 小刮匙取宫腔内膜标本 术前清洗外阴，消毒阴道宫颈，放置内窥器，再次碘伏消毒宫颈口、阴道侧壁，生理盐水擦洗宫颈口，小刮匙进行内膜取样，所获标本密封保存2份备检。1份密封送病原体培养，1份基因测序标本置细胞保存液，2～8 ℃保存送至实验室。

1.3 微生物培养 标本分别接种在巧克力琼脂平板、麦康凯平板和哥伦比亚血琼脂平板、沙保罗平板，并分区划线接种，部分于35 ℃、5%二氧化碳培养箱中进行需氧培养，部分置厌氧箱无氧培养，培养时间为72 h。

1.4 宏基因组学第二代测序

1.4.1 DNA提取：标本超声破碎后，按照试剂盒步骤提取DNA。

1.4.2 文库构建和测序 采用 Agilent2100Bioana-Lyzer质控文库插入DNA片段，按操作说明调整DNA文库浓度，然后经环化形成单链环形结构。环化文库经滚环复制生成的DNA纳米球，加载到测序芯片，使用 Bio-electronseq4000测序。测序数据去除低质量、长度小于35bp、人参考基因组序列。行微生物大数据库比对，并将比对后的数据按病毒、细菌（需氧菌、厌氧菌分类）、真菌、支原体、衣原体等分类排列。

1.5 慢性子宫内膜炎的治疗 应根据慢性子宫内膜炎病原体微生物的检测结果进行治疗。如革兰阳性球菌应用阿莫西林克拉维酸钾治疗，革兰阴性杆菌应用左氧氟沙星治疗，支原体、衣原体感染应用阿奇霉素治疗，厌氧菌应用替硝唑治疗，多种致病菌复合存在时联合用药或用多西环素治疗；针对宫腔镜检查及内膜病理提示内膜炎征象者，要按相应菌群抗感染的同时进行中医辨证论治2周，次月阴道放置阴道用乳杆菌活菌胶囊（商品名：定君生）治疗2周。

1.6 复查 疗程结束后于下月月经干净后3～7 d，取标本再次细菌培养及mNGS，提取原检测微生物DNA，检测治疗后微生物变化情况。

1.7 观察指标 首先，分析治疗前子宫内膜标本微生物培养法与mNGS法检测出的病原体的数量及种类、微生物检出阳性率；其次，对两组检测结果的一致性进行分析；第三，经过后续治疗后，对两种方法检测出的病原体复检阳性率进行比较；第四，评价mNGS对慢性子宫内膜炎的诊断价值。

1.8 统计学处理 数据分析统计软件使用SPSS21.0，计数数据对比采用χ2检验，用（n，%）表示，当P＜0.05提示数据差异有显著性。

2 结果

2.1 治疗前两种方法检测出的病原体数量及种类、微生物检出阳性率比较 传统微生物培养法的检出阳性率为20.80%（104/500）；mNGS法的检出阳性率为79.40%（397/500），有显著性差异（P＜0.05）。通过传统微生物培养法共检出104例，致病菌包括：肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、链球菌、粪肠球菌等。通过mGNS法共检出397例，除上述致病菌外，还检测出了细菌[阴道加德纳菌1例、金黄色葡萄球菌1例（图1）]、病毒（巨细胞病毒1例、乳头状瘤病毒1例）、支原体[解脲脲原体2例（图2）。

图1 mNGS检测出子宫内膜金黄色葡萄球菌感染结果

图2 mNGS检测出子宫内膜解脲脲原体感染结果

2.2 两种方法检测结果的一致性 在500例子宫内膜标本中，两组检测结果完全不一致的有105例（21.00%），检测结果不完全一致的有241例（48.20%），检测结果完全一致的有154例（3.00%）。

2.3 治疗后两种方法的复检阳性率比较 传统微生物培养法复检阳性率为13.46%（14/104），mNGS法复检阳性率为15.87%（63/397），可见，经治疗后mNGS法的转阴率显著高于传统微生物培养法，有显著性差异（P＜0.05）。

2.4 mNGS的诊断价值 以培养结果为金标准，mNGS的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为85.39%、58.92%、68.47%、61.09%。

3 讨论

微生物感染是诱导子宫内膜的炎症与氧化应激反应的重要介质[7]。既往有学者发现，慢性子宫内膜炎患者中有多种类型的病原体，细胞、病毒、支原体、衣原体等，共同参与了子宫内膜炎的发生发展过程[8]。因此，微生物侵袭是诱发子宫内膜炎症的常见病因[9-10]。由于微生物的特性，再加上药物的耐药性，子宫内膜炎患者的治疗应该依据不同的病原体进行个体化的治疗。抗菌药物的盲目大量使用会加重菌群的失调、微生物的耐药性，不利于患者胚胎的着床、发育。因此，快速、有效、可靠的检测出患者宫腔内的致病微生物，对后续的治疗以及预后都有着重大意义。mNGS法的检测覆盖范围很广，细菌、病毒、支原体等都能被检测出来，且敏感度很高。目前mNGS法主要是针对呼吸道、脑脊液、血液等部位检测，目前在病原体中检测的相关研究还比较少见。因此，本研究旨在通过对比宏基因组学第二代测序技术（mNGS）与传统微生物培养在慢性子宫内膜炎病原学检测结果的差异，评价mNGS在慢性子宫内膜炎病原学诊断中的优势。

mNGS法在慢性子宫内膜炎病原体检测中具有很高的敏感度，覆盖率很广。因此，我们对mNGS法的优势进行了总结，包括以下几点：①mNGS法具有更高的敏感度[11-14]。本研究中两种检测方法一致性的结果显示，传统微生物培养法有105例为阴性，而mNGS法检测出为阳性。既往认为，传统微生物培养法是血液感染金标准，但对微生物阳性率的检出率则受采血时间、采血量、培养次数等诸多因素的影响，即使有感染也未必会分离出细菌，因此传统微生物培养法检测为阴性也并不能排除感染的可能性。有文献显示，血传统微生物培养法的敏感度仅有40.00%[15]。因此，有必要对有怀疑的子宫内膜炎患者进行mNGS法检测[16-17]。本研究结果显示，在500例子宫内膜标本中，两组检测结果完全不一致的有105例（21.00%），检测结果不完全一致的有241例（48.20%），检测结果完全一致的有154例（3.00%）。经治疗后mNGS法的转阴率显著高于传统微生物培养法（P＜0.05）。以培养结果为金标准，mNGS法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为85.39%、58.92%、68.47%、61.09%。②mNGS法对少见菌的检测具有优势。厌氧菌对取样、标本培养的条件要求很高，且病毒只能在活细胞中才可以生长繁殖。在理论上讲，mNGS法并不依赖于培养，因此可以检测出并未检测出来的病原体。本研究结果显示，mNGS法的检出阳性率明显高于传统微生物培养法，有显著性差异。对两种方法检出的微生物类型进行比较，发现通过传统微生物培养法仅发现了一些致病菌，如肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、链球菌、粪肠球菌等。而mGNS法除了上述致病菌外，还检测出了细菌（阴道加德纳菌1例、金黄色葡萄球菌1例）、病毒（巨细胞病毒1例、乳头状瘤病毒1例）、支原体（解脲脲原体2例）。充分体现了mGNS法能够发现一些少见的、平时难以发现的病原体[18-20]。

综上所述，与传统微生物培养法相比，mNGS法具有更高的敏感度，能检测出更多的病原体。在慢性子宫内膜炎患者的治疗中能精准的指导抗生素的应用。