细胞自噬在食管癌中的研究进展

李婉莹 单探幽 闫锦阳 高社干

食管癌是侵袭性较强的恶性肿瘤之一[1]。流行病学研究[2-3]结果表明，食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)约占食管癌的90%，食管腺癌(esophageal adeno carcinoma，EAC)仅占10%，尽管两者具有地域分布和人种差异，但5年生存率均低于20%，且都与早期诊断困难、频繁的癌细胞转移和治疗敏感性降低有关。因此，亟待开发用于食管癌治疗的新标靶和新方法。

自噬是介导细胞降解和再循环的分解代谢过程，对于维持体内稳态和细胞发育至关重要。自噬可分为巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy, CMA)3种，目前得到最广泛研究的是巨自噬。巨自噬利用自噬泡将细胞质中多余和受损的细胞器，以及入侵的微生物包裹起来形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，水解囊泡中的内容物以重新合成营养物质和能量[4]。目前对于自噬泡脂质的来源仍存争议，其可能来自内质网、线粒体、高尔基体或质膜。本文将对巨自噬(以下称为自噬)在食管癌中的作用进行综述。

1 细胞自噬在食管癌发生、发展中的双重作用

正常情况下，大多数细胞的自噬水平较低，用于清除受损和多余的细胞器、错误折叠的蛋白质和入侵的病原体。自噬过程被认为是一种内源性防御机制，细胞在恶劣条件下(如缺氧、高温、饥饿和氧化应激)可通过提高自噬水平获取能量，维持生存[5-6]。此外，自噬还可参与细胞Ⅱ型程序性死亡，调节与肿瘤相关的炎症和免疫反应[7-8]，维持机体的正常代谢和基因组的完整性，从而抑制肿瘤的发生。在肿瘤进展阶段，自噬水平的提高可为肿瘤细胞提供能量，抑制其凋亡、促进侵袭，清理被化学治疗(简称化疗)与电离辐射损伤的大分子或细胞器，保护被攻击的肿瘤细胞，提高肿瘤细胞对放射治疗(简称放疗)和化疗(简称放化疗)的耐受性[9]。

1.1 自噬对食管癌的抑制作用 自噬对于维持正常机体基因组稳定、维持体内代谢平衡至关重要。Beclin-1是酵母自噬相关基因ATG6在哺乳动物中的同源基因，可被自噬相关激酶ULK1磷酸化，并作为磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)复合物的整体支架促进自噬相关蛋白定位到自噬泡[10]。临床研究[11]显示，33%的ESCC患者中Beclin-1蛋白表达缺失，且Beclin-1阳性组的生存率高于Beclin-1阴性组。动物实验发现，Beclin-1-/-突变型小鼠在胚胎早期死亡，而Beclin-1+/-突变小鼠肿瘤发生率增高，这与Beclin-1基因的表达量减少、自噬受损有关，表明Beclin-1是剂量依赖性的抑癌基因[12]。

为了证明自噬在Barrett食管(Barrett esophagus，BE)向EAC转化过程中的作用，有研究[13]检测了正常鳞状上皮细胞、非发育异常BE细胞、发育异常BE细胞和EAC细胞中的自噬水平，发现非发育异常BE细胞自噬小泡数量最多，而EAC细胞中几乎没有自噬小泡；将4种细胞暴露于以脉冲形式释放的酸性环境(pH值3.5)中孵育，非发育异常BE细胞和正常鳞状上皮细胞在与自噬抑制剂氯喹联合孵育时的氧化应激水平较单独暴露于酸性环境孵育时显著升高，并且4种细胞的死亡率显著增高；表明自噬可以减轻酸暴露造成的细胞损伤，促进细胞在氧化应激条件下存活，在BE进展中发挥重要作用。有学者用重组慢病毒载体转染Beclin-1基因构建了Beclin-1过表达的食管癌Eca109细胞系，结果显示Beclin-1过表达Eca109细胞中LC3-Ⅱ蛋白的表达水平较空载体组明显升高，而细胞增殖能力及侵袭性下降；进一步构建裸鼠皮下移植肿瘤模型，结果显示Beclin-1过表达组裸鼠的肿瘤生长速度明显低于空载体组[14]。上述结果提示，高水平自噬可抑制食管癌细胞的生长。

1.2 自噬促进食管癌的进展 微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)是自噬相关基因ATG8在哺乳动物中的同源物，可被自噬相关半胱氨酸肽酶ATG4B水解，形成细胞质定位的LC3-Ⅰ，在自噬过程中LC3-Ⅰ在ATG7、ATG3蛋白作用下与磷脂酰乙醇胺共价结合形成LC3-Ⅱ并转至自噬体膜。通常 LC3和LC3-Ⅱ都可作为细胞自噬的分子标志物，其表达水平与自噬的程度成正比[15]。

在食管癌进展阶段，自噬可清除受损细胞器为癌细胞提供能量，抑制癌细胞凋亡，降低治疗敏感性，促进癌细胞增殖。利用 Eca9706 和 KYSE150食管癌细胞系进行的体外研究[16]结果显示，肠癌转移相关基因1(metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)以自噬依赖性方式促进ESCC细胞增殖、迁移和侵袭。Chen等[17]的前瞻性研究纳入了43例ESCC患者，结果显示，caspase-3表达水平较低与LC3B水平较高、恶性转化程度较高的免疫组织化学结果和预后较差有关，且caspase-3与LC3B的表达水平呈负相关，表明自噬可能通过抑制细胞凋亡来促进ESCC的进展。一项纳入了253例ESCC患者的研究[18]也显示，LC3呈低表达的患者较高表达者治疗后的生存时间更长(71.1个月比55.5个月，P=0.022)，且较高的LC3表达水平是ESCC发生的危险因素(RR=1.407)。一项纳入了104例术前未接受放化疗和48例术前接受了放化疗的EAC患者的研究[19]结果显示，LC3B阳性与预后较差有关，但亚组分析则显示LC3B阳性与术前未接受放化疗的患者预后较好有关，但亦与术前接受了放化疗的EAC患者预后较差相关，一定程度上解释了放化疗对肿瘤基础自噬的影响[19]。一项meta分析纳入78篇文献共12 876例患者，其中有1 822例(14.2%)接受过放化疗，结果显示LC3B阳性与患者预后较差有关(HR=1.56)[20]。上述研究结果表明，食管癌在肿瘤进展阶段的自噬水平较高，且较高的自噬水平与患者预后不良有关。

总之，自噬在食管癌的发生、发展中具有双重作用。在正常生理状态下，自噬可以维持正常细胞的稳态，抑制食管癌发生；一旦正常细胞转化为癌细胞，由于自噬与细胞压力的动态平衡关系被打破，需要自噬为细胞提供ATP并维持细胞内环境的稳定，自噬就能促进癌细胞的生长和存活。

2 细胞自噬与微生态

自噬作为先天免疫的重要组成部分，是抵御病原菌入侵的重要屏障[21]，与此同时许多微生物已经进化出逃避或破坏宿主自噬得以生存并建立持续感染的策略[22]。Yang等[23]研究发现并定义了存在于食管中的两类微生物群，分别称为Ⅰ型和Ⅱ型微生物群：Ⅰ型微生物群主要由革兰阳性菌和链球菌属组成，与组织学正常的食管相关；Ⅱ型微生物群则主要由革兰阴性菌组成，与食管炎和BE的组织学证据存在相关性。一项针对ESCC患者的研究[24]发现，食管鳞状上皮异型增生(ESCC的癌前病变)和ESCC患者较健康人群食管及口腔微生物多样性低，且ESCC组织与非肿瘤组织梭状芽孢杆菌(Fusobacterium)丰度较高、链球菌(Streptococcus)丰度较低，表明ESCC患者存在食管和口腔微生态的异常。

有研究[25]在61%的ESCC患者组织中检测出牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)，但在健康对照组中未检出。P.gingivalis隶属拟杆菌门，研究[26]发现其能增加ESCC的发生风险，并且血清中抗P.gingivalis的IgG和IgA可作为生物标志物用于ESCC的早期筛查[27]。Guo等[28]研究结果表明， ESCC细胞中Beclin-1的表达水平随着P.gingivalis感染时间的延长而降低，而P.gingivalis感染或Beclin-1下调可增强ESCC细胞的增殖能力和迁移能力，降低ESCC细胞对紫杉醇的敏感性。上述结果表明，P.gingivalis感染可能通过影响细胞自噬，促进ESCC细胞增殖和迁移。

3 细胞自噬与食管癌的治疗

食管癌常见的治疗方案是进行手术切除后配合化疗和放疗，但患者较易出现抗性，影响了治疗效果。自噬促进了癌细胞耐药性的建立[9]。目前，临床上常用的自噬抑制剂为氯喹及其衍生物羟氯喹，为抗疟疾药物，可防止溶酶体酸化，阻止自噬泡被清除[29]。临床研究[30-32]已证实，氯喹及其衍生物羟氯喹能单独或与其他药物联合应用，通过抑制自噬提高黑素瘤、大肠癌、骨髓瘤和肾细胞癌患者的放化疗疗效，具有治疗潜力。但目前尚无利用上述自噬抑制剂在ESCC患者中进行试验的研究。

常用的化疗药物顺铂和5-氟尿嘧啶(5-fluouracil，5-FU)可调节细胞自噬。ESCC细胞系OE21和EAC细胞系OE33对5-FU和顺铂均表现出敏感性，这与促进细胞凋亡和抑制自噬相关[33]。与之相反，ESCC细胞系KYSE450和EAC细胞系OE19中则显示出对5-FU和顺铂的抗性，KYSE450细胞系中Beclin-1蛋白和ATG7蛋白的表达上调，降低了5-FU对自噬泡合成的抑制作用，表明自噬增强了癌细胞对化疗的抗性；常用的自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、氯喹和巴佛洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf-A1)均不影响KYSE450细胞对5-FU的敏感性，表明靶向干预自噬的途径不是由遗传损伤介导的[34]。在ESCC细胞系Ec109中，利用顺铂进行干预后，细胞自噬水平上调，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)激活水平降低；在异种移植肿瘤动物模型中，顺铂与氯喹联用时癌细胞的增殖受到抑制，而两种药物单独使用时均未对癌细胞产生明显的抑制作用，表明自噬降低了顺铂疗效的发挥[35]。

细胞自噬也与癌症靶向药物的治疗效果有关。人工合成的靶向bcl2蛋白质家族成员(细胞凋亡调节剂)对自噬有明显的调节作用。 GX15-070是一种化学合成的bcl2同源物3模拟药物，作用于ESCC细胞系EC9706后可诱导自噬，GX15-070单独或与5FU/卡铂联合使用可促进EC9706细胞死亡，联用自噬抑制剂3-MA可增强GX15-70诱导细胞死亡的作用[36]。人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，Her2)抑制剂与自噬抑制剂联合使用可增强对EAC细胞活性的抑制作用，可能有助于EAC的治疗[37]。甲磺酸酯(Obatoclax)是bcl2家族成员的泛抑制剂，介导bcl2家族成员的下调，在顺铂敏感和耐药ESCC细胞系中均表现出自噬抑制活性，导致细胞死亡；在这一过程中，甲磺酸酯可通过下调溶酶体蛋白酶的水平抑制癌细胞自噬，考虑到自噬和蛋白酶是蛋白质降解的主要细胞途径，因此推测甲磺酸酯与蛋白酶体抑制剂MG132结合可引起聚泛素化蛋白积聚，引起癌细胞死亡[38]。

目前已有多种天然化合物被用于食管癌的治疗。白藜芦醇是在红酒和食品中发现的一种植物抗毒素，具有抗肿瘤作用。在ESCC细胞系EC109、EC9706和K562中，白藜芦醇诱导了细胞G1期阻滞，促进细胞凋亡，联用自噬抑制剂可增强白藜芦醇介导的细胞死亡作用[39]。体外研究[40]显示，人参皂苷Rk3可限制ESCC细胞系Eca109和KYSE150的增殖和侵袭能力，与引起细胞周期G1期阻滞、促进细胞凋亡有关，降低PI3K/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路激活的水平；有趣的是，联用自噬抑制剂3-MA却抑制了Rk3的抗癌作用，表明自噬在这种情况下会促进癌细胞的凋亡。

4 前景展望

自噬在食管癌的发生、发展中起着重要且复杂的调控作用，并且能够影响其治疗效果。尽管已有研究证明自噬在BE向EAC转化的过程中起保护作用，但仍需要进一步开发体内研究模型探究自噬的调节机制。在考虑如何利用自噬抑制剂治疗食管癌时，关键在于了解细胞主体及基础自噬水平是否被打破。要准确判断患者的自噬是处于激活还是停滞状态，并结合是否接受放化疗等因素综合判断。此外，由于自噬调节肿瘤的复杂性，如何判断基础自噬水平，评估自噬发挥的作用，仍需要进一步开发新的检测系统，以实现特异性的调节自噬水平，更好地指导临床治疗。