丹参酮IIA对脓毒症肺损伤大鼠氧化应激的影响

黄约诺 叶威 郑青秀 潘锟镭 李献超 王世强 刘刚

脓毒症（Sepsis）是全身严重的炎症反应，随着疾病的发生发展，可造成许多器官的功能衰竭。每年全世界约14,000人因脓毒症而丧失生命。目前，由于脓毒症的发生发展机制并不清晰，因此其已发展成为临床诊治的一大难题。有研究表明，在众多并发症中，肺损伤是最早出现的且最为严重的［1］，同时其也是“高死亡率”的重要原因之一，死亡率达50%~70%［2］。有学者认为脓毒症所导致的肺损伤是由于氧化应激产生了大量的有害自由基，引起蛋白质结构被破坏，最终导致死亡率高、预后差［3］。而蛋白质变性后，肺组织分泌更多的血管活性物，肺毛细血管扩张，分泌的血管活性物质渗透到肺泡、肺间质，导致组织损伤、肺水肿［4］。近年来，随着分子生物研究发展，复方中药、中药单体被验证具有显著的疗效，对临床有一定的指导意义［5］。丹参酮IIA（TanshinoneⅡA，TanⅡA）是一种黄酮类化合物，属于近几年热门研究的中药单体—丹参的脂溶性成分，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基的作用，并且因其在肺脏中的浓度最高，受到研究者的注意［6］。本研究基于动物模型—脓毒症肺损伤大鼠，探讨热门中药单体—丹参酮IIA对脓毒症大鼠肺损伤时的机制及影响程度，为今后的临床诊治提供新的思路与理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 于上海斯莱克公司采购共50只SPF级健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，体质量220~250 g（动物合格证号：SYXK（浙）2021-0012），动物实验开展前1周，于浙江中医药大学动物中心常规饲养，所有动物采用白昼交替光照，保证正常的光照、温度、湿度、饮食。

1.2 实验药物与试剂 丹参酮IIA磺酸钠注射液（Aladdin，S107694）；黄嘌呤氧化酶试剂盒（酶联生物公司，ML654721）、丙二醛试剂盒（酶联生物公司，ML077384）、谷胱甘肽过氧物酶试剂盒（酶联生物公司，ML097316）、超氧化物歧化酶试剂盒（酶联生物公司，ML059387）。

1.3 实验分组及模型制备 50只SD大鼠编号，随机分成5组，每组各10只。假手术组：开腹翻动肠道，关腹，2 h后腹腔注射0.9%氯化钠溶液（20 mL/kg），24 h后麻醉并腹主动脉采血，直至大鼠缺血而死。模型组：经典造模方案——盲肠结扎穿孔法（CLP），评估造模成功后2 h后，每只大鼠采用腹腔注射方式，注射0.9%氯化钠溶液（20 mL/kg），然后，观察大鼠一般情况，并于24 h后，腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，评估麻醉成功后，于大鼠腹主动脉穿刺采集动脉血，大鼠最终因缺血宣布死亡。治疗组分3个组，即低剂量治疗组（丹参酮IIA 5 mg/kg）、中剂量治疗组（丹参酮IIA 10 mg/kg）、高剂量组（丹参酮IIA 20 mg/kg）：同样采用CLP术，2 h后分别腹腔注射丹参酮IIA（5、10、20 mg/kg），24 h后，将大鼠腹腔麻醉，采血针行腹主动脉采血，直至大鼠因缺血而死亡。

1.4 大鼠动脉血气分析 24 h后，采集大鼠腹主动脉血，行血气分析，计算动脉血氧合指数（PaO2/FiO2）。

1.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测大鼠左肺下叶肺组织中炎症、氧化因子含量 打开大鼠胸腔，剪下心肺，快速分离，用匀浆机将大鼠左肺下叶制备成肺组织匀浆，2,000 r/min，离心1 min，吸取上清液，严格按照实验试剂盒说明书，ELISA法检测肺组织匀浆标本中XO、GSH-Px、MDA、SOD含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料符合正态分布以（）表示，进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用LSD-t法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠动脉血气分析结果 与假手术组比较，模型组、低剂量治疗组（丹参酮IIA 5 mg/kg）、中剂量治疗组（丹参酮IIA 10 mg/kg）中氧合指数（PaO2/FiO2）结果都明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），高剂量组（丹参酮IIA 20 mg/kg）与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，3个不同剂量的治疗组中的氧合指数（PaO2/FiO2）结果都升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同组大鼠动脉血气PaO2/FiO2结果（）

表1 不同组大鼠动脉血气PaO2/FiO2结果（）

组别 只数 氧合指数（PaO2/FiO2） 与假手术组比 与模型组比假手术组 10 453.2±18.1模型组 10 303.1±8.9 ＜0.0001丹参酮IIA低剂量组 10 366.0±13.5 ＜0.0001 ＜0.0001丹参酮IIA中剂量组 10 383.7±17.1 ＜0.0001 ＜0.0001丹参酮IIA高剂量组 10 435.3±22.7 0.076 ＜0.0001 F值 373.856 P值 ＜0.001

2.2 丹参酮IIA对不同组左肺下叶肺组织炎症、氧化因子水平的影响 与假手术组比较，模型组及低、中剂量治疗组，XO、MDA含量升高，SOD、GSH-Px降低，差异有统计学意义（P＜0.05），高剂量治疗组与假手术组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；与模型组比较，三种剂量的治疗组中的XO、MDA均下降，SOD含量升高，有显著性差异（P＜0.05），然而在实验研究中发现，GSH-Px结果比较中发现高剂量组GSH-Px含量与模型组对比，有显著性差异（P＜0.05），低剂量组和中剂量组与模型组对比，差异无统计学意义，（P＞0.05）。见表2-6。

表2 不同组大鼠肺组织中XO、MDA、SOD、GSH-Px结果（）

表2 不同组大鼠肺组织中XO、MDA、SOD、GSH-Px结果（）

注：XO=黄嘌呤氧化酶；MDA=丙二醛；SOD=超氧化物歧化酶；GSH-Px=谷胱甘肽过氧化物酶；与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别 只数 XO（U/g） MDA（nmol/mg） SOD（U/mg） GSH-Px（U/mg）假手术组 10 2.5±0.3 16.5±2.5 56.2±8.1 32.2±5.2模型组 10 5.8±0.6* 42.4±6.6* 37.8±7.6* 25.3±3.9*丹参酮IIA低剂量组 10 4.2±1.5*△ 27.4±8.3*△ 44.3±12.3*△ 26.3±1.7*丹参酮IIA中剂量组 10 3.1±0.6*△ 24.2±8.5*△ 46.8±5.1*△ 26.9±3.9*丹参酮IIA高剂量组 10 2.4±0.8△ 17.2±7.1△ 55.4±8.3△ 29.9±3.8△F值 99.329 9.345 26.971 7.907 P 值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表3 不同组大鼠肺组织中XO结果分析及对比（）

表3 不同组大鼠肺组织中XO结果分析及对比（）

组别 只数 XO（U/g） 与假手术组比 与模型组比假手术组 10 2.5±0.3模型组 10 5.8±0.6 ＜0.001丹参酮IIA低剂量组 10 4.2±1.5 ＜0.001 ＜0.001丹参酮IIA中剂量组 10 3.1±0.6 0.01 ＜0.001丹参酮IIA高剂量组 10 2.4±0.8 0.516 ＜0.001

表4 不同组大鼠肺组织中MDA结果分析及对比（）

表4 不同组大鼠肺组织中MDA结果分析及对比（）

组别 只数 MDA（nmol/mg） 与假手术组比 与模型组比假手术组 10 16.5±2.5模型组 10 42.4±6.6 ＜0.001丹参酮IIA低剂量组 10 27.4±8.3 ＜0.001 0.020丹参酮IIA中剂量组 10 24.2±8.5 0.006 0.010丹参酮IIA高剂量组 10 17.2±7.1 0.648 ＜0.001

表5 不同组大鼠肺组织中SOD结果分析及对比（）

表5 不同组大鼠肺组织中SOD结果分析及对比（）

组别 只数 SOD（U/mg） 与假手术组比 与模型组比假手术组 10 56.2±8.1模型组 10 37.8±7.6 ＜0.001丹参酮IIA低剂量组 10 44.3±12.3 ＜0.001 ＜0.001丹参酮IIA中剂量组 10 46.8±5.1 ＜0.001 ＜0.001丹参酮IIA高剂量组 10 55.4±8.3 0.279 ＜0.001

表6 不同组大鼠肺组织中GSH-Px结果分析及对比（）

表6 不同组大鼠肺组织中GSH-Px结果分析及对比（）

组别 只数 GSH-Px（U/mg） 与假手术组比 与模型组比假手术组 10 32.2±5.2模型组 10 25.3±3.9 ＜0.001丹参酮IIA低剂量组 10 26.3±1.7 ＜0.001 0.863丹参酮IIA中剂量组 10 26.9±3.9 0.01 0.451丹参酮IIA高剂量组 10 29.9±3.8 0.616 ＜0.001

3 讨论

脓毒症是全身炎症反应，当机体出现难以控制的严重感染时，伴多个器官功能障碍时，则病情恶化快，预后差，死亡率高。随着病情的发生发展，患者呼吸困难，血气分析示难以纠正的低氧血症，表明肺脏是最早且最容易出现器官功能障碍，即ALI/ARDS，电镜下病理表现为肺间质充血、水肿［7］。尽管，在临床上，脓毒症患者已在重症监护室严密监测，予抗感染、休克等对症处理，但疾病病死率仍高、预后差，因此，重点着眼于中医药干预脓毒症所引起的肺损伤，并探讨中药的作用机制，探索干预方案，为临床诊治提供新的思路。在脓毒症肺损伤的发生发展机制中，有学者认为氧化应激反应起了重要的作用，导致死亡率高、预后差。SHI等人认为，氧化应激可能引起内皮和上皮屏障功能障碍，使大量中性粒细胞通过屏障，分泌细胞毒素，导致组织损伤、肺水肿［8］。杨丽梦等认为，其机制即为氧化与抗氧化失去平衡，当机体处于全身炎症以及氧化应激状态时，产生有害氧自由基，降低细胞的抗氧化活性，使得脂质过氧化增多，炎症因子大量产生，最终导致肺间质水肿。因此抗氧化治疗可能是一条有效的治疗路径［9］。

黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）［10］、丙二醛（malondialdehyde，MDA）［11］、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）［12］与谷胱甘肽过氧物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）［13］均和氧化应激存在着密切的联系。而本研究通过检测XO、MDA、SOD及GSH-Px的水平，发现丹参酮ⅡA具有通过抗氧化缓解脓毒症肺损伤的能力。

《中国药典》中记载中药丹参（Salvia miltiorrhiza）的功效为祛瘀止痛、活血通经及清心除烦。目前丹参已广泛应用于心血管疾病、肠道疾病、神经系统疾病以及过敏性疾病的临床治疗中，而它改善疾病的机制可能与抗炎、抗氧化和清除自由基、改善能量代谢、抗肿瘤、扩张血管等相关［14］。丹参酮IIA（TanshinonellA，TanllA）是一种黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化和清除自由基的作用。丹参酮IIA已经证实可以通过抗炎、抗肿瘤、清除氧自由基从而减轻大鼠肺纤维化［15］。陶静等发现丹参酮ⅡA可以通过减少炎症因子与减轻组织损伤从而缓解脓毒症心肌损伤［16］。王志敏等在慢阻肺大鼠模型中发现丹参酮IIA通过抗炎改善肺功能［17］。李俊峰等发现丹参酮IIA具有抗炎平喘、改善哮喘气道功能［18］。

在本研究中，采用CLP所引起的脓毒症大鼠模型。通过给予CLP大鼠丹参酮ⅡA后，CLP大鼠PaO2/FiO2升高，XO、MDA水平降低，SOD、GSH-Px水平升高。因此丹参酮ⅡA改善脓毒症肺损伤可能与抗氧化应激相关，这些研究为脓毒症肺损伤的治疗提供了新的方向。