胎球蛋白-A 调控糖尿病肾病足细胞损伤机制研究

戢晴 陶海英 吴海燕 丁国明

1.台州市第一人民医院肾内科，浙江台州 318020；2.台州市第一人民医院内分泌科，浙江台州 318020；3.台州市第一人民医院感染科，浙江台州 318020；4.台州市第一人民医院肾内科，浙江台州318020

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是一种以尿蛋白升高、肾小球滤过率下降、心血管病风险增加为特征的疾病[1,2]。DN 是糖尿病终末期肾衰竭的主要表现，具有较高的发病率和致死率[3]。足细胞是位于肾小球基底膜外侧的一种高度分化的细胞，当受到免疫或非免疫介导的介质攻击时，足细胞受损导致蛋白质丢失[4]。研究证实，胎球蛋白-A（fetoglobulin-a，Fetuin-A）在蛋白酶活性的调节和炎症因子分泌的抑制中可以发挥一定的生物学作用[5,6]。相关研究表明，Fetuin-A 高表达会导致足细胞损伤，可能参与糖尿病肾病的发生发展过程，但其具体机制尚不清楚。因此，本文旨在探讨Fetuin-A 调控糖尿病肾病足细胞损伤的机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取健康SD 成年大鼠15 只[山东大学，实验动物许可证号：SYXK（鲁）2020 0022]，鼠龄6～10 周，体质量（200±10）g，由中国医科大学实验动物中心提供，经动物伦理委员会批准（伦理审批号：WYZLL[2016]1601）。喂养7d，将枸橼酸缓冲液（滁州仕诺达生物科技有限公司，货号：SND2872）0.01mol/L 注射50mg/kg STZ 大鼠建模，连续3d。血糖＞16.7mmol/L 则建模成功，且建模成功大鼠已表现出典型糖尿病肾病表现。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 大鼠麻醉，取仰卧位，剪开腹壁，分离腹主动脉。采集主动脉血5ml，3000 转/min 离心10min，取血清，-80℃保存备用；取左肾生理盐水冲洗，取0.5cm 厚肾皮质组织置于4%多聚甲醛（碧云天生物技术有限公司，产品编号：P0099-100ml）固定，将组织块置于2.5%戊二醛（北京百奥莱博科技有限公司，货号：Y12820）4℃冰箱保存待检。

1.2.2 足细胞获取和培养方法 取出细胞，37℃水浴解冻，于离心管1000 转/min 离心10min，弃去上清液。100m2的培养瓶，37℃孵育24h，PBS 洗涤3次，加入100U/mL 的干扰素γ（interferon，IFN-γ）的无血清细胞冻存培养基（RPMI）1640 培养液，于33℃、5%CO2培养箱中，每3d 换一次培养液，倒置显微镜观察其生长变化。

1.2.3 细胞转染 将培养好的细胞按5×105个每孔，接于6 孔板中，生长至75%转染。将培养好的细胞分成3 组，每组8 孔，空白组不作处理，其余两组用Fetuin-A 抑制剂和Fetuin-Apmimic 进行转染。

1.2.4 引物序列 采用Real Time RT-PCR 技术检测3 组细胞Sp1、RIPK1、MLKL、WT1 表达。95℃预反应30s，然后95℃ 5s、60℃ 30s、40 个循环。

1.2.5 细胞凋亡 应用胰酶消化细胞，经PBS 冲洗2 次，收集细胞。加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜。离心收集细胞，加入溴化乙锭（50μg/ml），RNase A（100μg/ml），4℃避光孵育30min。采用高通量流式细胞仪（生产厂家：德国美天旎生物技术有限公司；型号：Analyzer 16）观察细胞凋亡。

1.2.6 肾组织Fetuin-A、TNF-α、MLKL、RIPK1 水平检测 采用免疫组化法检测肾组织胎球蛋白-A（fetoglobulin-a，Fetuin-A）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、混合系列蛋白激酶结构域蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL）、受体相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）水平。

1.2.7 Western blot 法检测 测定WT1、Sp1 水平，了解蛋白表达水平WT1、Sp1 相对表达量，用β-actin做蛋白内参。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行处理分析。计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），即F检验，应首先做方差齐性检验，两组比较采用独立样本t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组Fetuin-A 表达比较

24h、48h、72h 与对照组比较，下调Fetuin-A组Fetuin-A 表达较低，上调Fetuin-A 组Fetuin-A 表达较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与下调miR-125b 组比较，上调miR-125b 组miR-125b 表达较低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 3 组Fetuin-A 表达比较（）

表2 3 组Fetuin-A 表达比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与下调Fetuin-A 组比较，#P＜0.05

2.2 3 组足细胞增殖、凋亡比较

24h、48h、72h 与对照组比较，下调Fetuin-A组细胞吸光度值、凋亡率较低，上调Fetuin-A 组细胞吸光度值、凋亡率较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与下调Fetuin-A 组比较，上调Fetuin-A组细胞吸光度值、凋亡率较高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 3 组足细胞增殖、凋亡比较（）

表3 3 组足细胞增殖、凋亡比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与下调Fetuin-A 组比较，#P＜0.05

2.3 Fetuin-A 对3 组肾功能相关指标的影响

24h、48h、72h 与对照组比较，下调Fetuin-A组TNF-α、MLKL、RIPK1 表达较低，上调Fetuin-A组TNF-α、MLKL、RIPK1 表达较高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与下调Fetuin-A 组比较，上调Fetuin-A 组TNF-α、MLKL、RIPK1 表达较高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表4 Fetuin-A 对3 组TNF-α、MLKL、RIPK1 指标的影响（）

表4 Fetuin-A 对3 组TNF-α、MLKL、RIPK1 指标的影响（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与下调Fetuin-A 组比较，#P＜0.05

2.4 3 组细胞WT1 信号通路蛋白相对表达量比较

24h、48h、72h 与对照组比较，下调Fetuin-A 组WT1、Sp1 表达均较高，上调Fetuin-A 组WT1、Sp1表达均较低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与下调Fetuin-A 组比较，上调Fetuin-A 组WT1、Sp1 表达较低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5 和图1。

表5 3 组细胞WT1 信号通路蛋白相对表达量比较（）

表5 3 组细胞WT1 信号通路蛋白相对表达量比较（）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与下调Fetuin-A 组比较，#P＜0.05

图1 各组细胞相关蛋白表达

3 讨论

足细胞是一种高度分化的终末细胞，在肾小球功能调节中发挥重要作用[7,8]。Fetuin-A 磷酸化后其发挥生物学特性，可诱导胰岛素抵抗，抑制异位钙沉积，在炎症反应及脂质代谢过程中起重要作用，诱导TNF-α 等促炎因子的表达，引起机体或组织发生慢性炎症[9-11]。TNF-α 可促进炎症因子分泌，加剧炎症的作用[12]。相关研究证实，Fetuin-A 能抑制TGF-β 的信号通路，诱发低度炎症，造成足细胞损伤，促进糖尿病肾病的发展[13]。因此，本文旨在探讨Fetuin-A 调控糖尿病肾病足细胞损伤机制。

胰岛素可启动胰岛素信号的转导，活化胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS-1）、胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS-2）、PI3K蛋白激酶等多种信号分子，影响胰岛素的发挥[14]。Fetuin-A 可抑制胰岛素受体自身磷酸化抑制，增加足细胞分泌的负担[15]。本研究结果显示，足细胞凋亡数量在上调Fetuin-A 组显著升高，下调Fetuin-A组足细胞的凋亡数量明显减少，说明Fetuin-A 可能通过抑制机体低度炎性反应，抑制脂联素基因表达，诱导胰岛素抵抗，引起足细胞损伤和功能恶化及血管内皮生长因子过量表达等途径参与糖尿病及糖尿病肾病的发生与发展。Caspase-8 的激活与否是凋亡或坏死性凋亡的关键，当Caspase-8 激活受抑制时，RIPK1 去泛素化从而招募RIPK3、RIPK1/RIPK3 复合体招募并磷酸化MLKL，最终MLKL 孔通过允许离子流入、细胞膨胀和膜溶解导致坏死性细胞死亡并诱发炎性反应，因此RIPK1 与RIPK3 形成复合体以及MLKL 的磷酸化是坏死性凋亡的特异标志。研究发现，坏死性凋亡为糖尿病肾损伤的一种重要细胞死亡模式，不依赖Caspase 激活且具有典型坏死样形态，其通过RIPK1/MLKL 途径进行调节。坏死性凋亡是细胞程序性死亡的一种新形式，其途径主要由TNF-α 激活，RIPK1 去泛素化从而招募受体相互作用蛋白激酶RIPK3，二者磷酸化MLKL，导致坏死性细胞死亡[16,17]。

足细胞数量能反映足细胞丢失和增殖之间的平衡状态[18]。WT1 表达于足细胞核，反映足细胞数量及损伤程度，是足细胞的特异性标志[19]。Sp1 是一个通用的转录因子，在发育、细胞增殖、凋亡中发挥关键的调控作用[20]。本研究结果显示，上调Fetuin-A组TNF-α、MLKL、RIPK1 表达水平均升高，WT1、Sp1 表达水平则降低，说明Fetuin-A 过表达影响TNF-α、MLKL、RIPK1 表达水平，而三者水平升高是足细胞减少的重要原因，从而说明Fetuin-A 可以通过引起足细胞损伤，促进糖尿病肾病的发生与发展。

综上所述，Fetuin-A 靶向作用于Sp1 使足细胞损伤和功能失常。