奶牛围产期瘤胃菌群变化及影响因素研究进展

项开合，胡晓宇，李 爽，王 莹，张云现，张乃生*

(1.辽东学院农学院，辽宁丹东 118000；2.吉林大学动物医学学院，吉林长春 130062；3.齐鲁动物保健品有限公司，山东济南 250100)

奶牛围产期主要指奶牛产前3 周至产后3 周这一时期 ，其特征是动物生理发生剧烈变化，动物正常营养代谢和能量平衡的维持面临严峻挑战[1]。不同于单胃动物，奶牛体内能量供应主要来源于瘤胃发酵产生的大量挥发性脂肪酸，而瘤胃微生物在饲料发酵过程中发挥着至关重要的作用[2]。奶牛的瘤胃中存在丰富多样的微生物群落，如细菌、原生动物、古细菌和真菌等，它们与宿主具有共生关系。瘤胃微生物群落是动态的，往往随着饮食、宿主、生理状态和环境的变化而变化[3]。生产过程中，为了适应产后泌乳需要，围产期奶牛从干奶期高纤维饮食转变为高精料饮食，这种转变往往导致瘤胃菌群的剧烈变化[4]，并且可能与围产期疾病的发生存在密切关系。了解围产期奶牛瘤胃菌群组成、变化及影响因素，对于围产期奶牛饲养管理及疾病防控具有重要意义。传统的瘤胃菌群分析主要依赖细菌培养方法，而很多瘤胃内含量较低或生长条件苛刻的细菌无法通过体外培养获得。近年来，随着微生物组学与宏基因组学技术发展，使得更加深入细致的研究瘤胃菌群组成、变化、功能预测与分析成为可能。

1 围产期瘤胃菌群组成

围产期瘤胃活跃的菌群由20个细菌门组成，其中丰度最高的几个细菌门是厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)、纤维菌门(Fibrobacteres)、软壁菌门(Tenericutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)和疣微菌门(Verrucomicrobia)。在其他分类水平上，丰度比较高的是厚壁菌门的瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)，拟杆菌门的普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)，变形菌门的琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)，纤维菌门的纤维杆菌属(Fibrobacter)，螺旋体门的密螺旋体属(Treponema)[5]。Zhu Z等[6]通过对围产期奶牛瘤胃菌群分析发现最大优势菌门为厚壁菌门，其次是拟杆菌门和变形菌门，最大优势菌属为瘤胃球菌属(Ruminococcus)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、纤维杆菌属和丁酸弧菌属(Butyrivibrio)。与其他时期瘤胃菌群功能一致，围产期瘤胃菌群按照功能不同大体可划分为纤维素与半纤维素降解细菌，淀粉、蛋白及脂肪降解细菌，产甲烷菌、酸利用菌和乳酸产生菌[7]。

2 围产期瘤胃菌群特点

2.1 菌群丰度与多样性变化

瘤胃菌群适当的丰度，多样性和稳定性对瘤胃健康与瘤胃内环境的稳定至关重要。研究表明，围产期瘤胃菌群丰度往往随着时间的推移而逐渐降低，并且在泌乳期较低[8]。研究发现，母牛分娩后瘤胃菌群丰度和多样性降低[9]。产后早期奶牛瘤胃菌群丰度急剧下降，且这种下降比较短暂[8]。以谷物为基础的日粮进行饲喂，瘤胃菌群多样性普遍降低，这种减少可能与发酵结构碳水化合物的细菌可利用的底物减少以及随后的较低pH有关。同时，细菌多样性的减少与菌群丰度的减少有关，在以谷物为基础的日粮饲喂的牛也观察到了这种情况[10]。多数研究表明围产期菌群的这种变化趋势，即随着奶牛从干奶期过渡到泌乳期，从高纤维饲料转变到高精料饲喂，瘤胃菌群丰度和多样性随之下降。而在采集到的围产期瘤胃液样本中，没有观察到明显的菌群丰度和多样性变化[11]。总之，围产期瘤胃菌群变化迅速发生，表明细菌群落适应表现出来所需的时间很短。尽管随着精料比例的逐渐增加，瘤胃菌群丰度的降低变得不那么明显，但与产前相比，产后的丰度仍然较低。

2.2 菌群结构与组成变化

随着饲料及饲喂模式转变及距离分娩时间不同，奶牛围产期瘤胃菌群种类及丰度在不同阶段会发生相应变化，产前软壁菌门、绿弯菌门和疣微菌门所占比例较高，产后放线菌门(Actinobacteria)所占比例较高[12]。而作为瘤胃液中丰度最高的2个菌门，厚壁菌门与拟杆菌门细菌丰度及种类在围产期变化尤为明显。当奶牛从产犊前的饮食过渡到哺乳期的饮食时，最显著的变化是拟杆菌比例的增加和厚壁菌的减少[4]。与产前相比，产后拟杆菌与厚壁菌的比值几乎翻了一番(从6∶1到12∶1)。拟杆菌门的优势菌属普雷沃氏菌和拟杆菌属与产后瘤胃生态系统呈正相关，而厚壁菌门的瘤胃球菌属，丁酸弧菌属和克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)则在产前瘤胃生态系统中富集[12]。厚壁菌门/拟杆菌门比值(F/B)可以看做肠道菌群代谢潜能的生物标志，与某些疾病的发生、宿主的新陈代谢及生理健康密切相关[13]。产后瘤胃菌群的另一个值得注意的特征是链球菌和乳杆菌属的过度表达，作为瘤胃内重要的淀粉利用者及乳酸产生者，该类细菌随着产后高精料饲喂逐渐占据优势[14]。对干奶期及泌乳早期瘤胃菌群进行分析，发现随着精料增加，泌乳早期梭菌丰度较低，拟杆菌丰度较高，纤维杆菌相对丰度降低，相比于产前，气单胞菌(Aeromonadales)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、醋香肠菌属(Acetitomaculum)和未分类琥珀酸弧菌科细菌的相对丰度明显升高[8]。尽管缺乏足够的直接证据，但围产期瘤胃菌群的变化与迁移可能与某些围产期疾病发病率升高密切相关。瘤胃中革兰氏阳性产乳酸菌，如链球菌与乳酸菌大量增殖，可能导致pH降低，诱发亚急性瘤胃酸中毒(SARA)[15]。而随着产后产乳酸菌数量增加，但丙酸生成菌，包括反刍月形单胞菌和埃氏巨型球菌的数量显著减少，瘤胃中生成的过量乳酸不能及时分解，导致生糖先质及能量供应不足，导致酮病发病率升高[16]。

3 影响因素

3.1 品种和胎次

不同品种牛瘤胃菌群存在显著差异，而奶牛处于不同生理阶段也会对瘤胃菌群组成及丰度造成一定影响。调查产后饮食对处于围产期3个不同品种头胎奶牛瘤胃产甲烷菌群落的影响，发现娟珊牛瘤胃产甲烷菌Mbr.thaueri的平均丰度较低(26.9%)，荷斯坦纯种(30.7%)和荷斯坦-娟珊牛杂交牛(30.3%)较高[17]。研究发现，围产期饲喂相同饲料，与低产奶牛相比较，高产奶牛拟杆菌门丰度及拟杆菌门/厚壁菌门比值更高，布氏普雷沃氏菌(Prevotellabryantii)等多种与瘤胃液中丙酸摩尔比例显著相关的细菌丰度明显更高[18]。此外，通过围产期瘤胃菌群分析发现，无论在门水平还是属水平，初产母牛和多胎次母牛均存在显著差异[4]。其中，初产母牛主要表现为拟杆菌门增多，且普雷沃氏菌更为丰富，多胎次母牛主要表现为软壁菌门增多。

3.2 日粮

一般来讲，肠道菌群组成及功能主要取决于饲料种类及摄入量。高精料日粮常导致瘤胃菌群多样性下降，相反，高草料日粮常导致瘤胃菌群多样性升高[19]。对产后3周左右的中国荷斯坦奶牛进行饲喂试验，发现饲喂高精日粮奶牛瘤胃菌群丰度及多样性均低于饲喂低精日粮奶牛[20]。 围产期奶牛饲喂的主要特点是由干奶期的高草料饲喂转变为泌乳期的高精料饲喂，以提供更多的能量满足泌乳需要，为了尽量缓解分娩及泌乳应激，同时为瘤胃微生物提供足够的适应时间，通常选择在围产前期逐步更换饲料[21]。在奶牛围产期采用典型两段式饲喂方式，奶牛干奶期饲喂高粗料，产前21 d开始转换成高能量饲料直到泌乳，分娩后饲喂一般泌乳料[12]。结果表明，被认为是主要的瘤胃纤维分解菌的瘤胃球菌属和丁酸弧菌属在产前瘤胃生态系统中明显增多，产后自主性干物质采食量增加，能量代谢途径富集，主要表现为蛋白水解、淀粉水解和乳酸产生菌，包括普雷沃氏菌、链球菌和乳酸杆菌等组成的细菌属的富集。干奶期高粗饲料含有更高比例的纤维素，因此纤维素降解菌数量相对较高，而更换高精饲料后，由于饲料中含有大量谷物及其他易发酵碳水化合物，纤维素含量低，瘤胃发酵模式改变，纤维降解菌急剧减少，淀粉分解菌、蛋白分解菌数量快速增加[22]。

3.3 微生态制剂

在基础日粮中添加微生物能够调节瘤胃及肠道菌群，提高反刍动物生长性能和饲料利用率，并可能在一定程度上减少围产期疾病的发生。以多种酵母组成的复合微生态制剂饲喂围产期奶牛，发现瘤胃中布氏普雷沃氏菌(Prevotella)、栖瘤胃普雷沃氏菌(Prevotellaruminicola)、嗜淀粉瘤胃细菌(Ruminobacteramylophilus)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)、厌氧弧杆菌(Anaerovibriolipolytica)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)、反刍月形单胞菌(Selenomonasruminantium)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)的数量显著增加，在一定程度上抑制了乳酸杆菌及牛链球菌的生长，表明添加微生态制剂可以影响瘤胃菌群组成，并可能通过改变瘤胃发酵模式缓解能量负平衡，预防围产期疾病[16]。分析奶牛围产期饲喂活性酵母添加剂后瘤胃菌群变化情况，分别在产前14 d，产后7 d及21 d采集瘤胃液进行检测，发现相比于对照组，添加活性酵母后在产前14 d增加了拟杆菌、毛螺菌科和Flexilinea的相对丰度，在产后21 d增加了链球菌的相对丰度[23]。添加活性酵母对瘤胃菌群的影响作用主要表现在分娩前，不同的采样时间也会明显影响瘤胃菌群变化。

3.4 其他饲料添加剂

很多饲料添加剂都可以影响瘤胃发酵及菌群结构，从而提高发酵效率，保证瘤胃健康，其中抗微生物生长促进剂应用最为广泛。莫能菌素是一种聚醚类抗生素，能够选择性抑制某些微生物生长代谢过程，是最常用的反刍动物促生长抗生素之一。莫能菌素能够通过调节瘤胃菌群组成来影响甲烷、乙酸、丙酸的生成。随着抗生素的使用受到限制，很多植物性抗菌剂成为研究热点，显示出广阔的应用前景，如啤酒花苦味酸，可以抑制产甲烷菌生长，抑制牛链球菌等革兰氏阳性菌的生长，而对革兰氏阴性菌不敏感，显示出与莫能菌素类似的作用[24]。在犊牛饲料中添加牛至精油和莫能菌素，发现两者对瘤胃菌群都具有调节作用，添加牛至精油可使犊牛瘤胃蛋白降解菌丰度升高，产丁酸菌属丰度降低，更重要的是其可能对莫能菌素所导致的有益菌群的破坏具有一定缓冲作用[25]。此外，瘤胃保护性补充剂的应用越来越广泛，但其对瘤胃菌群影响作用尚未可知。在围产期奶牛日粮中添加瘤胃保护蛋氨酸，并在产前10 d和产后20 d采集瘤胃液检测瘤胃菌群，结果反刍兽月形单胞菌是丰度最高的细菌种类，与产前相比，产后脂解厌氧弧杆菌、瘤胃巨型球菌、布氏普雷沃氏菌， 反刍兽月形单胞菌和牛链球菌相对丰度升高，产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)、溶淀粉琥珀酸单胞菌(Succinimonasamylolytica)和溶糊精琥珀酸弧菌(Succinivibriodextrinosolvens)相对丰度下降[26]。

3.5 围产期疾病

肠道菌群紊乱能够导致多种疾病发生，很多疾病发生过程中存在菌群组成及结构变化。在反刍动物，由于瘤胃及瘤胃微生物的重要作用，瘤胃菌群正常与否对于奶牛机体健康尤为重要。奶牛围产期通常伴随酮病和低钙血症等代谢性疾病发生，并且往往导致子宫炎、乳腺炎、蹄叶炎、胎衣不下、真胃变位等疾病发病率升高[27]。瘤胃菌群的多样性及菌群构成会不断变化，瘤胃pH可能会影响瘤胃细菌群落的组成和多样性，反之亦然。同时，通过减少瘤胃pH的不利变化，奶牛瘤胃发酵可以适应重复的SARA挑战[28]。此外，奶牛酮病与瘤胃菌群组成及瘤胃发酵所产生的不同挥发性脂肪酸含量及比例密切相关，奶牛瘤胃菌群与亚临床酮病发生存在密切关联，其中相关性最强的是普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科细菌[29]。人工诱导SARA导致乳腺炎，瘤胃菌群紊乱是导致奶牛乳腺炎发生的重要内在因素，而寡养单胞菌(Stenotrophomonas)可能是导致乳腺炎发生的内源性病原菌之一[30],奶牛蹄叶炎也可能与瘤胃菌群紊乱所导致的血中乳酸升高及内毒素血症有关[31]。

4 展望

在奶牛围产期，从高纤维饮食转向低纤维饮食导致瘤胃菌群发生变化，并与多种围产期疾病的发生密切相关，对围产期瘤胃菌群的分析可以提供有关瘤胃菌群的群落结构和代谢特性的详细信息，进而可以用来改善反刍动物饲养策略，预防或治疗疾病。随着基因组学、微生物组学以及代谢组学技术的发展，我们得以对瘤胃菌群的结构、组成与功能进行更加深入细致的研究分析，但由于瘤胃中可以检测到的大多数细菌仍然无法通过分离培养方法获得，导致目前的研究仍然存在一定局限性，因此对围产期瘤胃菌群研究与分析仍然需要继续探索更加多样的试验方法，以期对围产期瘤胃菌群变化的影响因素及其所蕴含的意义有更加清晰的认识，为奶牛生产及围产期疾病的防治提供更加有价值的线索与帮助。