戊型肝炎病毒编码蛋白的功能与跨种属感染机制研究进展

段安乐，杨永林

(1.甘肃省第三人民医院，甘肃兰州 730030；2.泰州市人民医院 南通大学第五附属医院，江苏泰州 225300)

戊型肝炎(Hepatitis E)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)感染宿主所引起的一种人兽共患病，HEV可以通过多种途径从动物性宿主传播给人类引发戊型肝炎[1]。HEV感染动物后一般不产生明显症状[1]，但禽类HEV的感染可导致鸡肝脾肿大及母鸡产蛋量下降[2]。HEV从动物性宿主跨种属传播是目前我国人群感染HEV的主要原因[1]。HEV对普通人群致死率约0.5%到3%，但对孕妇致死率高达30%。大量研究表明人兽共患型HEV跨种属感染人类后可导致慢性戊型肝炎及肝脏外病变[3]，因此我国研究人员对于HEV的关注逐年增加。HEV动物性宿主的筛查发现猪和家兔为我国主要的HEV动物性宿主。但由于动物感染HEV后仅有显微水平的肝脏炎症而无明显症状，增加了动物HEV跨种属感染人的风险。本文总结归纳近年来在HEV编码蛋白的功能，HEV跨种属感染机制，以及病毒与宿主细胞的相互作用等领域取得的新进展，并对HEV可能的跨种属感染机制提出新的看法。

1 戊型肝炎的分型与基本病毒学特征

HEV为单股正链不分节段RNA病毒，是嗜肝病毒科(Hepeviridae)的唯一成员。感染动物和人的HEV可进一步分为正嗜肝病毒属(Orthohepevirus)，而美洲鳟鱼源来源的凶猛鳟鱼病毒则被单独划分为鱼嗜肝病毒属(Piscihepevirus)[4]。正嗜肝病毒属的成员可以依据动物宿主类型及核酸序列进一步划分为A～D 4个种并下设基因型。 早期HEV分类系统中主要感染人类的4种HEV基因型被列为正嗜肝病毒A种1～4基因型(HEV-1-4)[5]。在这4个基因型中，HEV-1和HEV-2只感染人类，而HEV-3和HEV-4除感染人类外则有多种动物宿主。其中HEV-3的主要动物宿主有猪、鹿、猫鼬、野猪和家兔，而HEV-4主要动物性宿主为猪、牛和绵羊[4-5]。HEV病毒粒子呈现典型的20面体对称形态，被长期认为是一种无囊膜病毒。近年来的研究发现HEV以脂质囊膜包裹的形式从被感染的细胞中释放，因此具有特殊的囊膜结构。此类HEV病毒粒子被命名为准囊膜化HEV(eHEV)[6]。尽管eHEV在体外培养系统上可感染细胞，但没有证据显示eHEV囊膜上具有囊膜蛋白。此外，有研究发现eHEV对易感细胞的感染效率远低于无囊膜HEV[7-8]，且识别HEV主要衣壳蛋白的抗体无法在体外试验上中和eHEV对靶细胞的感染[9]。因此，eHEV如何感染靶细胞有待进一步研究。

2 HEV的基因组结构及编码蛋白的功能

HEV基因组为7.2 kb的mRNA样核酸，含有5′帽子结构、3′多聚腺苷酸尾巴及非翻译区。一般认为HEV编码3个开放阅读框(ORF)[10]。HEV-ORF1蛋白可从病毒基因组直接翻译，编码与HEV复制相关的酶类[11]。HEV-ORF2和HEV-ORF3蛋白只能从2 kb大小的病毒亚基因组mRNA翻译且存在相互重叠现象[12]。HEV-ORF2主要编码病毒的衣壳蛋白，构成HEV病毒粒子。HEV-ORF3编码13 ku小分子多功能的磷酸化蛋白。此外，近年新发现HEV-1型病毒的第2701至2787核苷酸区域含有一个非经典内部核糖体进入位点(IRES)样序列，可启动IRES下游的HEV-ORF4(第2835-3308位核苷酸，完全嵌合于ORF1)表达，但该IRES序列在人兽共患型HEV及动物源HEV上不保守，因此其他动物源HEV是否编码ORF4依然未有定论。

2.1 HEV-ORF1蛋白的功能

HEV-ORF1翻译产生一个含有1700氨基酸的蛋白，是HEV编码的最大的蛋白产物。同源比对分析显示HEV-ORF1含有至少8个功能结构域[11,13]，分别为甲基转移酶结构域，Y结构域，木瓜样半胱氨酸蛋白酶结构域，X结构域，高变区结构域，脯氨酸富集结构域，解旋酶结构域和RNA依耐性RNA聚合酶结构域。大肠埃希氏菌表达ORF1部分功能结构域或多结构域截短体显示HEV-ORF1甲基转移酶结构域，蛋白酶结构域，解旋酶和RNA依耐性RNA聚合酶结构域等具有相应的酶活性[14]。HEV-ORF1蛋白也可拮抗宿主细胞的天然免疫应答信号[14]。此外，HEV-ORF1的高变区和脯氨酸富集结构域可以发生片段插入和缺失，呈现出多样化特征[15]。这一区域的插入和缺失片段与病毒在体外的复制效率有关[16]。如常用的HEV-3型病毒培养系统(KernowC1 p6毒株)在以上区域插入一段174nt的人核糖体蛋白S17序列，使HEV-KernowC1 p6毒株ORF1蛋白获得胞浆/核穿梭功能，从而增强病毒复制[17]。此外，不同基因型HEV-ORF1在这段高变区呈现出特异性差异，提示其与HEV在不同宿主的易感性及跨种属传播有关[17]。

2.2 HEV-ORF2蛋白及其功能

HEV-ORF2除编码病毒衣壳蛋白外，可在HEV感染细胞内以多种形式存在。HEV-ORF2全长约660氨基酸残基，其N端含有15AA的信号肽序列，可以在翻译后将全长ORF2蛋白导向内质网，且介导ORF2蛋白在137、310及562位的天冬酰胺(Asn)残基发生糖基化并以二聚体的形式从被感染分泌释放[18-19]。分泌型HEV-ORF2蛋白无法结合HEV的细胞受体，但可结合HEV特异性抗体从而在体内阻断抗体对HEV的中和作用。因此，分泌性HEV-ORF2蛋白被认为是HEV逃逸宿主体液免疫应答的一种特殊机制。成熟的HEV衣壳是ORF2从其编码序列内部第16位的起始密码子翻译产生的蛋白经过宿主蛋白酶作用去除N端前111个氨基酸残基与C末端的52氨基酸残基，所产生的56 ku单体蛋白组装而成[12]。利用杆状病毒重组表达的56 ku的ORF2截断体可以在体外自组装为病毒样颗粒且可作为疫苗使用。

2.3 HEV-ORF3蛋白及其功能

HEV-ORF3编码1个长度112至114氨基酸的蛋白，不参与HEV核酸复制但参与HEV的释放且调控细胞内多种信号通路。早期研究发现用HEV感染性克隆突变获得ORF3缺失型HEV无法在非人灵长类动物上建立感染。而将编码HEV-ORF3的质粒转染细胞发现ORF3蛋白可结合于细胞骨架中的微管蛋白，且ORF3蛋白可通过PSAP基序与内体筛选复合物系统中的关键蛋白肿瘤易感基因101发生互作。内体筛选复合物系统主要介导囊膜病毒以出芽的方式从细胞释放，提示ORF3蛋白可能利用内体筛选复合物系统完成HEV释放[13]。但这种观点与早期认为HEV颗粒无囊膜的特性不相符。HEV与甲型肝炎病毒(HAV)均具有裸露病毒粒子和特殊的准囊膜化病毒粒子的两种形态，同时有研究确认HEV-ORF3除调控内体筛选复合物系统形成类囊膜HEV颗粒外，其具有病毒孔蛋白活性，可介导HEV粒子通过内体筛选复合物系统从被感染细胞中释放[20]，并且附着于病毒衣壳蛋白上形成准囊膜化HEV病毒粒子。准囊膜化的HEV可被识别ORF3的单克隆抗体捕获，提示HEV-ORF3可能是HEV结构蛋白。HEV-ORF3蛋白在HEV复制的过程也可调控包括宿主天然免疫应答在内的多种细胞内信号通路[14]。序列分析显示OrthohepevirusA种内的8个基因型HEV编码的ORF3氨基酸序列N端(1-60aa)相对保守，而C端(61-114aa)除高度保守的PSAP基序外其他序列存在明显差异，提示除参与病毒释放和准囊膜粒子的形成外，不同基因型来源的ORF3蛋白还具有其他特定功能。

3 HEV编码蛋白的功能与跨种属感染

人兽共患型HEV及来源于动物HEV样病毒被分离鉴定以来，依据HEV基因型分型及宿主范围，HEV可以被划分为人源限制性HEV(HEV-1或HEV-2)，人兽共患型HEV(HEV-3，HEV-4与HEV-7)及动物源限制性HEV(如禽源HEV)三类[21]。大量研究认为除宿主本身外，不同基因型HEV所编码的蛋白功能在HEV跨种属感染中发挥关键作用。

在所有病毒蛋白中，ORF1蛋白长期被认为在HEV跨种属感染及决定HEV宿主嗜性中发挥关键作用。用反向遗传学手段在HEV-1感染性克隆骨架上将ORF1编码序列替换为HEV-4型ORF1，所获得的嵌合病毒具备在猪的肾脏细胞上复制的能力[22]。将HEV-1的5′非编码区以及ORF1与2之间的连接区域替换为HEV-3序列后产生的嵌合病毒却无法感染猪[23]。尽管HEV-1和HEV-3的ORF1不同功能结构域片段互换所产生的嵌合病毒可在人肝癌细胞上进行复制，但这些嵌合病毒均无法在动物试验上跨种属感染猪[24]，提示ORF1蛋白不是决定HEV跨种属感染和宿主嗜性的唯一因素。

作为HEV的主要结构蛋白，ORF2蛋白的氨基酸序列在不同动物来源的HEV中相对保守。分析显示感染人类的HEV-1至HEV-4在ORF2上的同源性超过86%[25]，因此ORF2蛋白最早被认为与HEV的跨种属感染无关。将人与猪共患型HEV-3/4的ORF2蛋白通过反向遗传学替换为感染人的HEV-1-ORF2所产生的嵌合病毒无法感染猪，显示ORF2蛋白在决定HEV宿主范围上发挥重要作用。对ORF2蛋白的功能结构域替换显示将HEV-3型ORF2蛋白456-605位氨基酸替换为HEV-1型ORF2上对应的序列后，所获得的嵌合病毒无法在体外试验上结合猪源细胞[13]，证实ORF2蛋白在决定HEV宿主范围和跨种属感染过程中有重要作用。由于尚未鉴定出HEV的细胞受体，因此，HEV-ORF2蛋白与细胞受体之间的互作如何决定不同基因型HEV的宿主范围有待进一步研究。

除ORF1与ORF2蛋白外，ORF3蛋白在决定HEV宿主范围及跨种属感染方面同样发挥重要作用。ORF3蛋白通过第95-98位的PSAP基序与宿主TSG101蛋白互作参与HEV释放且该基序在不同物种HEV中应当高度保守[20]。但大鼠HEV-ORF3在同一位置上的氨基酸基序为PxYPMP[13]。因此，大鼠HEV-ORF3蛋白并不结合TSG101蛋白，而是用多泡状小体途径来实现病毒粒子释放，完全不同于人类及其他哺乳动物源HEV，提示HEV-ORF3存在基因型特异性的功能且可能与HEV跨种属感染或宿主范围有关。此外，序列比对发现HEV-ORF3的C末端序列(62-114aa)在不同基因型或宿主来源的HEV中并不保守[13]，可能与病毒在不同的宿主上的适应有关。而ORF3在HEV基因组的位置在不同种属来源的HEV上存在明显差异。大部分哺乳动物源HEV的ORF2与ORF3编码序列仅存在部分重合，而禽源HEV与美洲鳟鱼源HEV的ORF3的编码序列则完全嵌合于ORF2中，提示HEV-ORF3在不同宿主适应的过程中存在宿主或基因型特异性的演化过程，并可能具有相应的特殊功能，最终影响HEV宿主范围[13]。感染人类的4种不同基因型HEV对应的ORF3蛋白在增强模式识别受体介导的干扰素产生的功能上确实存在差异[13]。因此，基因特异性的HEV-ORF3蛋白的功能可能影响到HEV在特定宿主的感染力与复制水平，进而影响到病毒的跨种属感染。

4 展望

自从20世纪90年代末确认HEV存在动物宿主并且是唯一的人兽共患肝炎病毒以来，HEV得到越来越多兽医及医学研究人员的重视，并且鉴定出大量的动物源HEV及相应的动物宿主。我国作为HEV的高流行区域，如何预防HEV的跨种属感染是一个重要的公共卫生问题。目前尚无兽用的HEV疫苗获批上市，且HEV的跨种属感染机制及宿主嗜性范围仍然有待深入研究，因此临床兽医及一线医务人员对HEV认识程度有待提高。