以畜禽疱疹病毒为载体的重组基因工程疫苗研究进展

张 璐，何慧芬，秦爱建,2，钱 琨,2,3*

(1.扬州大学 教育部禽类预防医学重点实验室/江苏省动物预防医学重点实验室，江苏扬州 225009；2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009；3.扬州大学比较医学研究院，江苏扬州 225009)

接种疫苗是预防和控制畜禽疫病发生与传播的最具成本效益的干预措施，也是兽医学中使用最广泛的工具。自人类历史上的第一代疫苗的发明到今天，疫苗的研发已经历了数百年时间，经过不断地研发和改进，目前研发成功的疫苗主要有以下几种类型[1-2]：①传统的灭活苗和弱毒苗：主要为灭活或减毒病原体或利用清除病原体的亚基如毒素、多糖或蛋白质等制成的一类疫苗；②基因工程疫苗：是利用基因工程技术或化学技术合成的一类疫苗，主要包括亚单位疫苗、合成肽疫苗、病毒或细菌活载体疫苗等；③核酸疫苗：是利用基因工程技术将编码某种抗原的外源基因直接导入动物机体内表达，诱导机体产生免疫应答的一类疫苗。随着对各种病原微生物的深入了解及生物技术的高速发展，基因工程疫苗的开发是新型疫苗的主要方向，其中重组活载体疫苗成为研究的热点。

1 畜禽疱疹病毒活载体疫苗概述

自1984年将痘病毒开发为疫苗载体以来，已经探索了多种病毒在活载体疫苗中的应用。目前全球市场中可见的至少有12种病毒载体疫苗已获准用于兽医领域[3]，如新城疫病毒(La Sota株)、禽痘病毒、火鸡疱疹病毒等。疱疹病毒是一类有囊膜的双链DNA病毒，基因组中普遍存在病毒复制非必需的基因，这为外源基因的插入提供了得天独厚的位点，可以携带多个相同或不同病原的抗原基因，用于制备多价苗或者多联苗。疱疹病毒还具有感染广泛宿主细胞和诱导或分散免疫反应的潜力，利用疱疹病毒构建的活载体疫苗可诱导特异性黏膜免疫，在神经细胞中建立潜伏感染，达到一次接种，终生免疫的效果。但也存在一定的缺陷，比如在病毒载体上只能插入引起完全保护性免疫反应的抗原，且外源基因在病毒载体中表达还可能改变其组织嗜性。目前已有多种疱疹病毒用于活载体疫苗的研发，如伪狂犬病毒、家禽疱疹病毒、牛疱疹病毒等。其中梅里亚公司生产的明星产品威力克(HVT-VP2)疫苗是一种将传染性法氏囊病病毒中的VP2基因插入到火鸡疱疹病毒中构建而成的活载体疫苗，能有效保护传染性法氏囊病毒和马立克氏病病毒的攻击[4]，广泛应用于生产实际。

2 畜禽疱疹病毒活载体疫苗构建的主要技术方法

2.1 同源重组

同源重组是普遍存在于自然界中的生物学现象，可以双向交换DNA分子，也可以单向转移DNA分子。研究者们根据同源重组原理，实现对宿主DNA的缺失、插入和置换突变。利用同源重组法构建重组疫苗的过程相对简单,可以省去很多的时间和精力，是目前使用最多的方法。如用伪狂犬病病毒同源重组猪细小病毒VP2基因[5]。但同源重组效率低,不容易筛选。为了解决这一难题，科学家们做了多方面尝试。①选择合适的病毒活载体。即在插入外源基因后不影响亲本病毒的复制增殖，其次是要具有一些复制非必需区或基因间隔序列为外源基因的插入提供靶点；②同源臂的长度。研究表明，同源臂过长或过短均会影响外源基因的重组效率，一般大于1 kb；③外源基因表达盒的长度。表达盒过长不容易整合到病毒载体中；④选择恰当的重组病毒筛选方法，可一定程度上相对提高重组效率。随着分子生物技术的发展，研究者们在传统同源重组技术的基础上建立了更加简单、快速、高效同源重组技术，即Red/ET、Cre/loxp和FLP/FRT重组技术。这些重组系统高效简单，不需要任何其他分子的参与，通常与细菌人工染色体、 CRISPR/Cas9基因编辑技术等联合使用。

2.2 细菌人工染色体

细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)是一种以F质粒为基础构建而成的细菌染色体克隆载体。由于BAC的复制速度特别慢，对于疱疹病毒而言，构建BAC重组毒相对容易和准确，在适宜条件下能快速产生新病毒，并且能够稳定遗传。有研究把鼠巨细胞病毒(Mouse cytomegalovirus, MCMV)整个基因组克隆为感染性BAC,这一技术在多种疱疹病毒中获得成功[6]。但是BAC的构建过程较复杂、周期长，当克隆较大基因组时，基因组易在操作中发生断裂而影响病毒拯救，并且可能在病毒基因组中残留一些细菌基因组序列，不符合疫苗生产的生物安全要求，因此在利用BAC系统研发重组疫苗时，还需进一步考虑敲除残留序列。

2.3 黏粒

黏粒是指一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体，已有大量不同的黏粒载体用于克隆病毒以及细菌的基因组。该方法操作简便、构建周期短并易于进行改造。但黏粒系统的容量有限，对于一些较大的基因簇需要分段克隆，两个黏粒之间如果存在同源序列会发生重组，导致DNA序列的重排或丢失，且含不同重组DNA的菌落生长速度不一，会出现外源DNA的比例失调，包装效率不稳定等现象。针对此问题有人开发了一种新型黏粒即Fosmid，该载体系统稳定性好、无偏向性、拷贝数可诱导、构建周期短以及操作简便，最近几年被广泛用于基因文库构建[7]。

2.4 CRISPR/Cas9基因编辑技术

CRISPR/Cas9系统属于Ⅱ型CRISPR/Cas系统，是结构最简单的系统，能高效地介导基因定点敲入或敲除,同时沉默任意数量基因[8]。CRISRP/Cas9基因编辑技术主要分为两个过程。首先，Cas9蛋白特异性切割目标DNA序列，产生DNA双链断裂；其次，在DNA修复系统的修复过程中实现DNA序列的改变。根据这一原理人工设计sgRNA(guide RNA)来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，人工提供修复模板后可达到将外源基因敲入病毒基因组的目的。CRISPR/Cas9相比其他方法具有构建方便、简单快捷及性价比高等优点[9]。但同时也存在诸多问题，首先是存在较高的脱靶概率，其次是导入目的基因后存在Cas9酶的残留，目前还没有有效的手段在Cas9-sgRNA奏效后去除Cas9。除此之外，CRISPR修饰位点受到PAM序列和sgRNA的限制，近期还有研究表明应用CRISPR/Cas9基因编辑还可能会导致基因突变。

3 畜禽疱疹病毒重组基因工程疫苗的研发

3.1 伪狂犬病病毒载体

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)基因组约143 kb,各基因的功能基本确定。研究表明，PRV部分基因的缺失或替换不影响病毒的复制与传播，用猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的囊膜糖蛋白E1来取代PRV基因组中非必需糖蛋白gX，构建1株有效的PRV减毒活疫苗。此后大量的PRV基因缺失苗被成功研制，其中Bartha K61和PRV SA215已被商业化使用。由于这些疫苗安全有效，可用做重组疫苗的载体，目前已经确定了PRV基因组中几个常用的基因插入位点，如TK、gI、gE、PK和gG 基因等。常见的重组外源病毒包括猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪流感病毒、日本脑炎病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒及非洲猪瘟病毒等。此外，还有某些寄生虫如弓形虫、血吸虫等保护性抗原在PRV中也有所表达。

研究发现，在PRV基因组中不同位点插入相同抗原构建的重组病毒的免疫保护效力有所不同。如在gI/gE、gG/gD位点插入猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白，高滴度免疫可使猪完全免受CFSV的攻击[10]，而在US9位置插入CSFV E2蛋白，未能诱导产生针对E2蛋白的抗体[11]。此外，在PRV基因组中相同位点插入不同抗原构建的重组病毒其免疫保护效果也有所不同。如在gG位置插入猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2能诱导产生针对PCV2的中和抗体，而插入Cap蛋白，却未能检测到针对Cap的抗体。由此可以得出，重组病毒的免疫保护效果或许与外源基因和插入位点有关。此外，还有研究表明共表达细胞因子和保护性抗原能增强重组病毒的免疫保护效果[12]。除了在常见位点TK、gI、gE、PK和gG等插入外源基因能够产生较好的免疫保护效果外，在UL40/41的非编码区插入猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) S基因构建的重组PRV，免疫断奶仔猪也能诱导产生低水平的抗体[13]。这为PRV活载体疫苗的构建提供了新的技术支持。目前，大多数表达外源基因的重组PRV都是同源重组的方式构建，这可能与同源重组技术构建简单方便且技术成熟等因素有关。相反，CRISPR/Cas9这种新兴的能高效介导基因定点敲入的方法应用较少，直到2018年非洲猪瘟迅速席卷全国，急需研制有效疫苗预防和控制该病的发生与传播，用CRISPR/Cas9构建表达ASFV CD2v蛋白的重组PRV，免疫后诱导小鼠产生抗CD2v特异性抗体和细胞免疫反应，100%保护小鼠免受毒株PRV-Fa的攻击[14]。这为CRISPR/Cas9技术在PRV重组病毒中的应用奠定了基础，也为非洲猪瘟的防控提供了技术支持，在今后的研究中用CRISPR/Cas9技术同时插入多个外源基因可能会成为PRV重组病毒研究的主要趋势。

近年来大多重组PRV都能诱导产生相应的特异性抗体或细胞免疫反应，甚至部分重组病毒对强毒的攻击有完全保护作用，但这些重组病毒未得到商业化应用。分析原因可能包括以下几个方面[15]：①需优化病毒感染和复制，以生产高效、安全的疫苗，此项工作复杂繁琐。②需要对重组PRV构建中掺入的一些非必要基因进行敲除，从而使其更适合临床应用。③将现有疫苗转换为重组疫苗的周期较长，需制定长期计划。④由于临床试验成本过高，导致许多对于重组PRV 的研究尚未推进到自然宿主猪中，无法预测评估一些实际问题。

3.2 马立克氏病病毒载体

马立克氏病是由马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染引起的家禽免疫抑制及肿瘤性疫病。目前MDV也是唯一能用疫苗预防的肿瘤性疾病。其中MDV-1型中的CVI988/Rispens 株和火鸡疱疹病毒(Herpes turkey virus,HVT)是目前应用最广泛的疫苗株。由于MDV是细胞结合型病毒，主要在细胞间传播，能很好的抗母源抗体的干扰，故自1988年起研究人员便开始研发重组MDV疫苗。近年大部分禽类的常见病原体的保护性抗原在HVT中均有表达[16]，成功构建了HVT二价苗,此外还有同时插入两个不同外源基因的三价HVT也被成功构建，具有一定的免疫保护效果[17]。

目前，在HVT中外源基因的插入位点多集中在UL45/46,例如在此位点构建多种表达不同亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)HA基因的重组疫苗，包括H7N1、H9N2，其免疫保护效果不尽相同。而在US2位点构建的AIV(H5)-重组HVT具有针对抗原漂移的H5Nx病毒提供交叉保护和阻止排毒的潜力[18]。以HVT为载体表达新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因的重组病毒在1992年被首次构建，对于NDV的攻击具有部分保护作用。在之后研究中，将NDV F或HN基因插入HVT的不同位点构建的重组病毒均有完全保护作用。研究发现表达Ⅰ型NDV F及Ⅵ型NDV F和HN的重组HVT可提供针对Ⅶ[19]型和Ⅳ型交叉临床保护[20]。表达传染性法氏囊病病毒(Infections bursal disease virus,IBDV) VP2蛋白的重组HVT，即威力克疫苗，能对致命IBDV攻击提供完整持久的保护，被广泛应用于生产实际。此外，同时表达IBDV VP2和NDV F的重组HVT被成功构建，也得到了商品化应用[21]。而在相同位点表达其他病原的双价或多价重组HVT虽有较好的保护效果，但未得到商品化应用，这可能与表达的外源基因不同有关。

随着MDV强毒株的出现，HVT的保护效果受到了限制，相继的以MDV-1型CVI988/Rispens株、814株以及一些Meq缺失株为载体的重组MDV被成功构建[22]。与HVT不同的是，MDV-1型毒株中外源基因的插入位点和构建方法较为单一，CVI988/Rispens株插入位点主要集中于IRS-US连接区和sorf1/sorf2，均由同源重组方法构建；814株中的插入位点主要集中在US2位点，主要通过Fosmid构建；Meq缺失株的插入位点几乎都在Meq区，主要通过BAC构建。对这些重组疫苗的免疫保护效力进行评价，结果显示大部分重组病毒有一定的保护作用。

3.3 传染性喉气管炎病毒载体

传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)中的gG、gJ、gM 和 gN是病毒的复制非必需基因，许多基因缺失的重组ILTV被成功构建，如缺失UL47、gC、ORF C、TK、UL10和UL49.5、UL50以及UL0，免疫鸡后都提供了一定的保护作用。近年来构建了多种表达高致病性禽流感病毒(HPAIV)不同亚型的HA和NA基因的ILTV重组病毒。H5的HA/N1基因插入UL50基因位点,H7亚型的HA基因插入UL0位点。这些重组ILTV对ILTV和AIV均有一定的保护作用，其中ILTV-DeltaUL50IH5V能够保护鸡免受 H5亚型的不同 HPAIV分离株的侵害[23]。以同源重组或CRISPR/Cas9等方法分别构建了3种表达基因Ⅶ型 NDV F蛋白的重组病毒[24-25]。3种重组病毒保护效果较好，有望成为二价疫苗候选株。

3.4 鸭肠炎病毒载体

鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV) 的TK、US1、US10和US2等区域为DEV复制非必需区[26]。目前可供插入的位点主要有TK、UL27/26、UL44、US7/8、gE等。已有研究报道了表达禽流感病毒、小鹅瘟病毒、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸭肝炎病毒及鸭坦布苏病毒等病毒保护性抗原的重组DEV被成功构建，大部分重组病毒免疫动物后有一定的免疫保护效果，少数重组病毒未进行免疫保护效力评价。在DEV基因组不同位点表达AIV不同亚型HA基因的重组病毒，均有较好的免疫保护效果。例如，在DEV疫苗株的US7和US8基因之间插入禽流感病毒H5N1 AIV的HA基因得到的重组毒，能快速且稳定的的产生针对于H5N1 AIV的保护作用，并且在之后的研究中还发现rDEV-us78HA对异源 H5N6和 H5N8 AIV也有保护作用[27]。在gI、gE、US2位点表达鹅源H5N1 AIV HA的重组DEV免疫鸭后产生抗 DEV和AIV特异性抗体，能抵抗 DEV病毒的感染[28]。然而在US7-US8基因之间表达的NDV La Sota 株F蛋白和HN蛋白，只有rDEV-F对NDV F48E9株感染有100% 的保护作用，而rDEV-HN无免疫保护作用。这表明重组疫苗的免疫保护效力可能与插入的外源基因有关。

3.5 牛疱疹病毒1型载体

以牛疱疹病毒1型(Bovine herpesvirus type 1,BHV-1)为载体的重组病毒研究主要集中在口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)和伪狂犬病病毒(PRV)。目前已有多篇报道利用牛疱疹病毒1型(BHV-1)表达FMDV VP1基因[29]。此外，一些报道指出FMDV的P1-2A/3C的表达能够诱导针对FMDV的保护性免疫[30]，将P1-2A/3C表达盒整合到BHV-1基因组中，发现FMDV 3C蛋白酶的表达会干扰BHV-1 的复制。将PRV糖蛋白gC基因插入到BHV-1的TK基因中，随后构建了表达PRV的gB、gC、gD、gE基因的rBHV-I。但在该重组体中，gB基因和gD基因不能同时表达，因此又构建了能同时表达PRV糖蛋白gB、gC、gD、gE 和 gI的重组病毒BHV-1/TF17-1，对PRV攻击有良好的免疫保护效果。2002年研究证实了表达PRV gB和gC基因的重组BHV-1/TF7-6在小鼠中诱导的免疫反应强于亲本病毒。此外，还有少量以在BHV-1为载体表达其他病原的重组病毒被成功构建。例如，在gE启动子后面表达牛呼吸道合胞病毒G蛋白的重组体能防止牛呼吸道合胞病毒的感染。在BHV-1 TK启动子控制下表达牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白的重组体可作为候选疫苗。将在CAG启动子控制下的隐孢子虫的p23基因整合到BHV-1的gG基因中，得到的重组毒在兔体内诱导产生了中和抗体。最新的研究结果表明大角羊肺炎的病原体的毒力基因插入BHV-1的gC位点构建的重组疫苗未能提供免疫保护作用[31]，但为其他肺炎病原体基因的插入提供了技术支持。除此之外，国内的学者还构建了表达兔出血症病毒、牛副流感病毒3型及牛流行热病毒抗原基因的重组BHV-1，但均未进行免疫保护效力评价。

4 展望

近年来畜牧业临床中密集的疫苗接种，导致病原体变异加速，部分传统的疫苗已经无法为动物提供良好的保护作用，免疫减负成为了需要关注的问题。病毒活载体疫苗虽然可以解决部分问题，但目前大部分的重组疫苗未得到商业化应用。主要的原因包括外源基因的插入影响载体病毒的复制和毒力，并且多个外源基因之间也可能存在相互影响，病毒基因组中残留一些非必要的序列，影响重组疫苗的安全性，与其他疫苗共免疫时，不同疫苗之间产生不良的相互作用等。

为了进一步提高重组疫苗质量，在构建病毒活载体重组基因工程疫苗过程中，几点影响重组疫苗质量的因素必须考虑：①了解载体与免疫系统之间的关系有助于病毒载体的开发；②外源基因密码子的优化可提高表达量；③启动子的选择影响外源基因的表达；④与某些细胞因子共表达可提高外源基因的免疫效果；⑤不同插入位点影响不同外源基因的表达量及稳定性；⑥联合免疫佐剂可增强黏膜免疫反应。基于这些现有的结论，在未来疱疹病毒载体疫苗或其他病毒载体疫苗的研发中有望进一步优化重组疫苗的研发，从而能更加有效地控制畜禽疫病，提高经济效益，保护人和动物的健康。