免疫检查点在乳腺癌中的应用研究进展

严峻锋 邱福铭

乳腺癌是当前世界上女性发病率第一位的恶性肿瘤，2018年，全球有200万例乳腺癌被确诊[1]。随着肿瘤免疫研究的进展，人们发现免疫逃逸在肿瘤发生、发展方面起关键作用。一方面肿瘤细胞能够通过免疫编辑手段使本身的免疫原性发生改变，从而逃避免疫监视[2]；另一方面肿瘤微环境中的一些因子可以保护肿瘤细胞不被免疫系统识别和杀伤[3]。当前已有多种抗肿瘤免疫机制被发现，如能够增加免疫系统抗原识别能力的肿瘤疫苗，有补充细胞毒免疫细胞的过继细胞疗法，以及解除T细胞免疫抑制的免疫检查点抑制治疗等。在这些疗法中，免疫检查点抑制治疗已在黑色素瘤、肾癌、非小细胞肺癌和其他部分实体肿瘤中取得了显著的临床效果[4]。近些年，乳腺癌相关免疫检查点抑制疗法也获得了极大进步，然而各免疫检查点的基因表达模式各不相同，不同的免疫检查点在肿瘤中的治疗评估价值也不尽相同。本文对免疫检查点概况、肿瘤免疫检查点抑制治疗现状以及乳腺癌相关免疫检查点的研究与治疗应用进展作一综述。

1 免疫检查点的概念

健康机体的免疫系统维持在一个动态的平衡，免疫反应过低可增加感染及肿瘤的发生概率，而免疫反应过强则会导致自身免疫系统疾病的发生[5]。通常情况下，那些通过抑制机体免疫反应，控制效应细胞过度激活，避免免疫病理损伤的共抑制分子叫免疫检查点[6]。免疫检查点发挥着稳定机体免疫功能，调节对外来抗原免疫应答的强度、幅度、持续时间，防止发生自身免疫系统疾病的重要功能。肿瘤微环境中的一些细胞因子可促进间质内调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）表达免疫检查点受体，肿瘤细胞也可促进自身免疫检查点相关配体的表达上调，待配体结合受体，可通过其特定的氨基酸序列激活下游的抑制性磷酸酶从而实现免疫逃逸。通常，在机体免疫执行方面，T细胞发挥着关键作用，其能够被特异性抗原所识别，从而发生活化产生免疫效应，抑制肿瘤患者体内免疫检查点，解除T细胞免疫抑制，激活机体抗肿瘤免疫反应，已成为杀灭肿瘤细胞的重要有效途径。

2 肿瘤免疫检查点抑制治疗现状

一般情况下，免疫检查点对免疫反应起负调节作用，当免疫细胞持续活化时，其表达升高，从而避免过度伤及正常组织；当免疫检查点被激活时，免疫细胞被抑制而不能引发细胞毒性反应，肿瘤就是利用这个调节功能来获得生存优势[7]。肿瘤的免疫疗法即利用免疫检查点抑制剂降低肿瘤细胞对T细胞的免疫抑制，活化杀伤性T细胞，从而再次使机体具备抗肿瘤免疫功能，由此实现对肿瘤的有效消灭。目前已有4类免疫检查点抑制剂由美国FDA批准上市：ipilimumab，其可有效抑制细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen4，CTLA-4）；pembrolizumab以及nivolumab，这两类可有效抑制程序性死亡因子-1（programmed death1，PD-1）；atezolizumab，此类可有效抑制程序性死亡因子配体-1（programmed death ligand1，PD-L1）[5]。ipilimumab 为首个 FDA 批准的靶向CTLA-4的全人源化单抗药物，可对抗原呈递细胞（antigen presenting cell，APC）以及T细胞的活化通路进行干扰，以此解除免疫抑制，是最早批准临床用于转移性恶性黑色素瘤治疗的药物。pembrolizumab是第一个获美国FDA批准的PD-1靶向单抗，在解除T细胞的免疫抑制和恢复抗肿瘤免疫应答方面较现有的其它单抗具有更强的效应。Ribas等[8]发布了一项包含655例晚期黑色素瘤患者使用pembrolizumab的临床研究结果，显示其客观缓解率（objective response rate，ORR）达33%，1年的无进展生存率为35%，总生存期达到了23个月。目前pembrolizumab已被广泛用于黑色素瘤、肺癌的治疗；Rizvi等[9]研究显示nivolumab在非小细胞肺癌治疗过程中的中位起效时间为3.3个月，明显长于一般化疗的疗效评价时间；有关atezolizumab的临床试验也正在进行中。

3 乳腺癌相关免疫检查点的研究与治疗应用

免疫检查点抑制剂在治疗恶性黑色素瘤以及非小细胞肺癌方面已取得了一定突破，乳腺癌虽然也开始了很多探索性研究，但目前尚无大量临床应用的经验。Gaynor等[10]研究发现，乳腺癌组织中存在着大量免疫检查点。针对不同类型的乳腺癌，免疫检查点的表达程度也有所不同，如CTLA-4、PD-1在三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）中特异性增高最多，而ADORA2A在激素受体阳性型乳腺癌中最高。在预后价值和疗效评价方面，B7-H3 mRNA在乳腺癌中的表达与预后呈负相关，在Luminal型患者中更为明显，TIGIT在乳腺癌中高表达却提示预后较好，B7-H3的表达与环磷酰胺疗效呈负相关[11]。下面列举了目前较为热门的乳腺癌相关免疫检查点的研究结果及应用进展。

3.1 CTLA-4 CTLA-4主要由活化的T细胞表达，CTLA-4和CD28都能与APC表面的B7分子结合，然而在结合后释放的效能方面，双方却完全相反，CD28与B7分子结合后，可正向调控T细胞活化，CTLA-4与B7分子结合后则会负向调控T细胞活化。CTLA-4抑制T细胞活化的作用机制可能有以下两种：一是CTLA-4与APC表面的B7配体结合后，通过其胞外域占位效应竞争性抑制CD28共刺激信号；二是通过其胞内的YVKM基序，活化其下游的抑制性酪氨酸磷酸酶-2及蛋白磷酸酶-2A，酪氨酸磷酸酶-2可使CD3ζ链发生去磷酸化，导致T细胞受体信号减弱，而蛋白磷酸酶-2A可以使蛋白激酶B去磷酸化[12]。Yu等[13]对130例乳腺癌患者的临床病理特征与生存情况分析发现，CTLA-4不仅表达在乳腺癌细胞上，在肿瘤间质淋巴细胞上也有表达，两者总CTLA-4表达高的患者预后更差。

目前用于乳腺癌研究的抗CTLA-4药物主要有两种，ipilimumab 和 tremelimumab。McArthur等[14]将 18例乳腺癌患者术前治疗分成ipilimumab单药组，冷冻消融组和联合治疗组，研究发现，与冷冻消融组相比，ipilimumab单药组的外周血中辅助T细胞1（T helper cell 1，Th1）型细胞因子、Ki-67+CD4+和 CD8+T 细胞、ICOS+CD4+和CD8+T细胞的数量均有显著升高；对术后标本中肿瘤浸润淋巴细胞（tumour infiltrating lymphocytes，TILs）进行流式细胞仪分析发现，联合治疗组的Ki-67+效应T细胞/调节T细胞比率明显高于其他两组。Vonderheide等[15]通过tremelimumab联合芳香化酶抑制剂治疗26例雌激素受体阳性的进展期乳腺癌患者，结果显示，患者体内Treg数量减少，ICOS+T细胞数量增加。此外，还有两项关于转移性乳腺癌联合用药的临床试验正在进行当中：ipilimumab联合信号转导与转录激活因子-3和肿瘤干细胞自我更新抗体的研究[NCT02467361]；组蛋白脱乙酰酶抑制剂联合nivolumab和ipilimumab在人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor 2，HER-2）阴性进展期乳腺癌的研究[NCT02453620]。

3.2 PD-1/PD-L1 PD-1为T细胞表面一类发挥着关键作用的抑制性调节受体，其与CD28、CTLA-4一样，皆属于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，因能促进程序性细胞死亡而得名，能够被部分因子诱导后表达于部分具有活性的细胞表面，如T细胞、自然杀伤细胞、B细胞与巨噬细胞等。PD-1的细胞内分布着1个免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motif，ITIM）和1个免疫受体酪氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine-based switch motif，ITSM），ITSM基序通过酪氨酸磷酸酶家族调节磷酸酶的召集，不光抑制细胞外信号调节酶的活化，还对磷脂酰肌醇-3激酶以及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶的活化进行阻抑[6]。PD-1的配体主要有PD-L1和PD-L2，以PD-L1为主，隶属Ⅰ型跨膜糖蛋白B7超家族。在细胞分布上，PD-L1和PD-1一致，在卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤和黑色素瘤等人类肿瘤细胞株中表达上调[16]。研究发现，PD-L1可对Treg的分化起促进作用，PD-L1在肿瘤细胞表面的表达量愈高，肿瘤微环境中Treg量随之愈多，肿瘤细胞生成的相关抑制性因子诸如IL-10、TGF-β等的量随之愈多。TGF-β能够反向上调APC表面PD-L1的表达，而APC表面表达的PD-L1又通过释放抑制性可溶性分子到肿瘤微环境直接抑制T细胞的抗肿瘤作用[17]。相较于Luminal型乳腺癌，PDL1在TNBC以及HER-2阳性乳腺癌内表达显著偏高，Li等[18]在一项系统回顾和荟萃分析中发现，PD-L1在Luminal型乳腺癌患者的表达率为22.3%，而HER-2阳性患者的表达率为30.4%。Muenst等[19]发现，乳腺癌组织内PD-L1表达与患者预后显著相关。

目前已用于乳腺癌治疗的PD-1/PD-L1单抗药物主要有 pembrolizumab（MK-3475）、nivolumab（BMS-936 558/MDX-1106）、PDR001、atezolizumab（MPDL3280A）、durvalumab（MEDI4736）。与CTLA-4特异性抗体主要是在外周淋巴器官中抑制T细胞活化的作用不同，PD-1/PD-L1单克隆抗体主要在肿瘤微环境中改善效应T细胞功能，因此，PD-1/PD-L1单抗不良反应小，安全性较好。两项关于pembrolizumab用于进展期TNBC 的研究 KEYNOTE-086[20]及 KEYNOTE-119[21]均显示：对于PD-L1阳性复发性TNBC患者，pembrolizumab具备可耐受性与安全性，其疗效与PD-L1表达水平呈正相关，在PD-L1阳性组中，pembrolizumab相比化疗在总生存上表现更佳。PANACEA研究[22]显示，抗PD-1治疗PD-L1阳性HER-2阳性乳腺癌也有一定的获益。目前研究PD-1/PD-L1在HER-2阳性乳腺癌中的抑制作用的试验还包括pembrolizumab联合trastuzumab 和 pertuzumab[NCT03988036]，pembrolizumab联合抗HER-2疫苗[NCT03632941]。更进一步的药物临床试验，如 nivolumab[NCT02309177]、durvalumab[NCT02649686]、PDR001[NCT02404441]正在进行中。

3.3 CD39/CD73 CD39是一种细胞外三磷酸腺苷水解酶，正常情况下，CD39主要表达在人和哺乳动物Treg上，主要的功能有抑制炎症反应、抵抗血小板聚集、调节细胞增殖等。CD73是一种胞外核苷酸酶，广泛存在于大多数组织，控制着离子交换、体液转运、血小板凝集、组织耗氧以及毛细血管通透性等多种生理作用。CD39能够水解细胞外三磷酸腺苷和二磷酸腺苷生成一磷酸腺苷，一磷酸腺苷继而被CD73分解，生成具备免疫抑制功能的腺苷。腺苷在控制机体天然免疫以及调节性免疫方面，作为效应分子发挥着重要作用，经由结合效应T细胞以及自然杀伤细胞表面的腺苷受体，提升细胞中的环磷酸腺苷，导致CD25上调受抑，由此使得效应T细胞增殖能力变弱，免疫因子生成量下降，自然杀伤细胞活性削弱[23]。可见，CD39-CD73-腺苷通路[24]在免疫应答中发挥着关键性调控作用。CD39在大多数实体肿瘤包括头颈部肿瘤、结直肠癌、肝癌、胃癌等均明显上调，高表达于慢性淋巴细胞白血病内[25]，然而CD39在乳腺癌上表达情况罕有报道；CD73在正常乳腺和乳腺癌中，均有不同程度的表达，在发生转移的乳腺癌中该分子的表达及活性明显升高，其表达程度与肿瘤分级和淋巴结转移呈正相关，同时负向相关于雌激素受体表达[26]。Allard等[27]发现，CD73在TNBC的表达要高于其它亚型，表达越高预后越差，对化疗药物的耐药越显著。

目前，抗CD73单克隆抗体或小分子抑制剂已经在肿瘤小鼠模型中证明其抗肿瘤作用[28]；CD73单抗药物MEDI9447、IPH5301[29]和选择性小分子抑制剂AB680[30]也已经进入早期临床试验；评估CD73抑制联合PD-1/PD-L1抑制剂疗效的Ⅰ期临床试验也正在进行中[NCT02503774]、[NCT02655822]。

3.4 淋巴细胞活化基因-3（Lymphocyte activation gene 3，LAG-3） LAG-3是一种跨膜糖蛋白，隶属于超级免疫球蛋白家族。和CD4一样，LAG-3的配体也属于一类主要组织相容性复合体-Ⅱ（major histocompatibility complex classⅡ，MHC-Ⅱ）类分子，当 LAG-3与MHC-Ⅱ结合后，不但能够削弱T细胞活性，加速T细胞衰竭，还能调控树突状细胞的分化成熟[31]。LAG-3与MHC-Ⅱ类分子的亲和能力虽然比CD4高，然而双方不存在竞争性，双方功能完全相反，其和CTLA-4、PD-1相同，皆为共抑制因子[32]。LAG-3与MHC-Ⅱ类分子间的作用可以抑制抗原刺激的CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖，在使用LAG-3单抗阻断后，包括TNF-α、IFN-γ与IL-2在内的Th1型细胞因子分泌量升高[33]。LAG-3还可通过调控CD4+CD25+Treg的抑制功能间接发挥抑制作用[34]。

IMP321是一种重组的LAG3-Ig融合蛋白，它能够与活化APC上的MHC-Ⅱ结合，使记忆性CD8+T细胞发生活化，释放抗肿瘤活性[35]。Brignone等[36]对30例转移性乳腺癌患者使用紫杉醇联合IMP321的疗效进行研究[NCT00349934]，结果发现实验组的自然杀伤细胞和细胞毒效应记忆CD8+T细胞的表达明显上升，90%的患者临床获益，仅3例患者在6个月中进展，肿瘤ORR达50%，比对照组明显高出25%。另一项关于IMP321在激素受体阳性的进展期乳腺癌患者中的IIb期临床试验正在进行中[NCT02614833]。其他正在进行的关于LAG-3的乳腺癌临床研究药物还包括LAG525[NCT03742349]、INCAGN02385[NCT03538028]、XmAb22841[NCT03849469]和 TSR-033[NCT03250832]。

3.5 T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域-3（T cell Ig and mucin domain 3，TIM-3） TIM-3最初被发现是一类存在于全分化型分泌IFN-γ CD4+Th1和CD8+细胞毒性T细胞的特异标志，进一步研究发现，TIM-3也表达于Treg、单核巨噬细胞以及树突状细胞的表面[37]。现已明确的TIM-3配体主要有S型凝聚素半乳凝素-9、癌胚抗原相关细胞黏附分子-1、高迁移率族蛋白B-1。TIM-3的作用机制主要为调控T细胞增生以及细胞因子的分泌，可以直接在CD4+T细胞上表达发挥抑制作用，也可以通过在其他免疫细胞上表达来调节CD4+T细胞的活性[38]，另外，TIM-3同时对骨髓源性抑制细胞的扩增具诱导作用[39]。CD8+T细胞是特异性免疫杀伤肿瘤的主要免疫细胞，肿瘤释放的TIM-3能够影响其增殖能力及效应功能来逃避免疫监视[40]。Ndhlovu等[41]研究发现TIM-3也在无活性自然杀伤细胞上表达，通过干扰自然杀伤细胞产生细胞因子的能力及调控其直接杀伤作用来发挥免疫抑制功能。

在乳腺癌中，TIM-3不但可以调控CD8+T细胞的数量，而且发现IL-15能够利用TIM-3调节肿瘤内CD8+T细胞的抗肿瘤反应[42]。TIM-3不包括任何已知的抑制信号基序，因此相比PD-1和CTLA-4，TIM-3在T细胞抗原受体的信号调节位点不是依赖已知的ITIM[43]，靶向TIM-3能够使治疗的精准度提升，显著减轻对健康组织的免疫伤害。目前关于抗TIM-3治疗肿瘤的研究数据很少，正在进行的抗TIM-3药物在晚期实体肿瘤患者中的Ⅰ期临床试验包括：MBG453[NCT02608268]、TSR-022[NCT02817633]和 INCAGN02390[NCT03652077]，其中可能包括部分乳腺癌患者，最后结果如何尚需等待。

3.6 吲哚胺-2，3-双加氧酶（indoleamine 2，3 dioxygenase，IDO） 色氨酸是维持机体细胞增殖以及活化的一类必需氨基酸，IDO是肝外仅有的能够催化色氨酸沿犬尿酸通路分解代谢的限速酶，目前发现IDO高表达与大肠癌、宫颈癌等肿瘤预后差密切相关，其作用机制与其代谢产物、血管生成有关。目前多个研究已证实IDO与肿瘤微环境的免疫耐受有关，IDO能够使肿瘤微环境内色氨酸耗尽，直接影响T细胞的活性，同时其代谢物质犬尿氨酸对T细胞凋亡具有诱导作用，IDO还可能通过诱导T细胞向Treg分化或者直接活化成熟的Treg来发挥免疫耐受作用。Chen等[44]的研究发现IDO的代谢产物可以增加乳腺癌的转移，乳腺癌中IDO表达越高者预后越差，尤其是在TNBC亚组[45]。Isla等[46]发现IDO不只存在于乳腺癌细胞中，也存在于乳腺癌微环境的微泡中，参与癌细胞的迁移以及免疫逃逸。

目前围绕IDO的表达强度和抗IDO干预反应相关性的临床试验仍处于初级阶段。Ⅰ期临床试验药物以indoximod为主，indoximod是IDO的竞争性抑制剂，该药物在乳腺癌中已显示出单药活性[47]，并且与多西紫杉醇联合使用取得了一定疗效[NCT01792050][48]。Gu等[49]在4T1乳腺癌模型的试验中发现，indoximod具有抑制CD4+Foxp3+T抑制细胞扩增和刺激CD8+T效应细胞活化的功能，并能够与IL-12、GM-CSF协同作用，增强抗肿瘤免疫治疗效果。此外，大多数IDO阳性的浸润性乳腺癌同步表达PD-L1（70%），提示多靶点联合治疗比单一治疗可能更有效[50]。indoximod联合p53抗原的疫苗试验也正在进行中[NCT01042535][51]。关于IDO抑制剂的Ⅰ期研究还有：BMS-986205、GDC-0919[52]，epacadostat[53]。ECHO202研究结果显示，在对TNBC进行治疗方面，采取epacadostat+pembrolizumab疗法，可实现10%的ORR，以及36%的疾病控制率[54]，围绕BMS-986205+nivolumab[NCT02658890]及 GDC-0919+atezolizumab[NCT02471846]的研究也正处在进行阶段。

3.7 B与T细胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA） BTLA是一个具有免疫球蛋白样构造的共抑制性分子，同属CD28家族。BTLA的胞质区包含一个与CTLA-4、PD-1一样的ITIM和ITSM，可负向调节外周免疫耐受与应答。BTLA结合自身配体后，产生负性免疫调节作用。静息状态下，BTLA高表达于B细胞上，但低表达于T细胞、pDC、KT细胞与自然杀伤细胞上，激活后，BTLA在B细胞上表达下降而在T细胞中呈上升趋势，尤其是Th1细胞，这是一种反向相互作用[55]。BTLA对T细胞存活虽然具备维持作用，但会减少其增殖和活性，从而促进外周免疫耐受，限制抗肿瘤免疫[56]。BTLA还可与其它共抑制性分子如PD-1、TIM-3等协同抑制T细胞功能[57]。因此，它被认为是一种T细胞抑制性受体[58]。多项研究发现，BTLA在1型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肾移植等慢性疾病中具有重要的免疫调节作用，由此推测，BTLA在机体免疫应答中有控制免疫反应时间的长短的作用，对免疫应答起精细调节，这种调节在维持外周耐受中的作用可能较CTLA-4及PD-1更有意义。

关于于乳腺癌，BTLA仅见少量基因层面的研究，Fu等[59]对592例黑龙江省的恶性乳腺癌患者的BTLA基因型多态性关联性分析，得出5种基因型与乳腺癌的部分临床病理参数相关。Curtis等[60]对2 000例乳腺癌基因和转录组分析后显示，在高ZBTB16水平患者群中，高BTLA表达的患者预后更差。

4 小结与展望

免疫疗法是否有效取决于该肿瘤是否具有免疫原性，乳腺癌能引起免疫反应的依据主要有以下几点：（1）乳腺癌微环境中存在着大量TILs；（2）癌细胞中免疫相关基因表达和乳腺癌预后相关；（3）基因不稳定性导致突变增加，产生许多新抗原[61]。HER-2阳性乳腺癌和TNBC已被确认为最具免疫原性乳腺癌亚型，是最有可能通过免疫疗法获益的乳腺癌分子分型。atezolizumab已被批准用于治疗TNBC[62-63]，而针对HER-2阳性乳腺癌的PANACEA研究[22]也显示了潜在的良好效果。目前还没有确切证据表明TILs在激素受体阳性乳腺癌中的表达[64]，故Luminal型乳腺癌能否在免疫治疗中获益及获益的程度需进一步的研究来探讨。

因免疫反应具有记忆功能，故同当前主流的抗肿瘤疗法相比，免疫疗法的作用时间更持久，更适合于晚期肿瘤或经各种辅助治疗后又复发的患者，已在多种肿瘤类型中显示了较好的优势，将来有可能发展成为一种不良反应小，且更有针对性的消除残留肿瘤细胞的方法。免疫检查点抑制治疗在乳腺癌中仍处于初始阶段，其他肿瘤已取得的获益在乳腺癌中是否同样存在仍有争议，其中CTLA-4与PD-1/PD-L1抑制剂在乳腺癌上的治疗效果已具备确切性，更多免疫检查点抑制剂新型药物也正在进行临床研究。另外，因肿瘤同免疫系统双方相互作用的复杂程度，单一靶点药物治疗效果有限，多靶点联合治疗策略或许可以更彻底解除抗免疫抑制，提高免疫反应率[61]。联合多个免疫疗法以及免疫疗法与化疗、放疗或靶向治疗的结合疗法，已经初见成效。在不断发掘新靶点的同时，检验哪些疗法的组合可以产生最大的临床效益，以及研发合适的生物标志物来预测肿瘤对这些治疗策略的反应性是今后研究的另一个重点。