视网膜类器官3D培养技术的研究进展△

舒会叶 韦 芊 邵 毅

视网膜退行性疾病是一组以视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器细胞进行性减少为特征的不可逆性疾病。虽然目前临床上暂无有效的治疗方法，但有一些基础研究和临床试验表明细胞移植疗法具有治疗视网膜退行性疾病的潜力。细胞移植技术大多以视网膜原代细胞为供体进行移植，在移植后通过替代或保护宿主失代偿细胞起到改善视力的作用[1]。许多研究表明，在晚期视网膜退行性疾病移植治疗中应用早期有丝分裂后的感光细胞效果最好[2]。由于人供体细胞通常来源于 2～3个月龄胎儿，并且存在伦理及细胞来源不足等问题，所以直接从人体中分离获取这种感光细胞在临床上是比较困难的[1]。这种感光细胞一般来源于新生小鼠视网膜。因此，体外获得大量可供移植的感光细胞成为临床应用的必要前提。

多能干细胞拥有分化成各种细胞和大量扩增的能力，通过3D培养技术可以高准确度和高产量地产生特定类型的细胞(如肝、肾、肠、大脑等组织的细胞)。这种类器官培养技术可以为治疗视网膜退行性疾病提供大量感光细胞。在过去的10多年中，多项研究发现人胚胎干细胞(hESCs)和人工诱导的多能干细胞(hiPSCs)具有逐步分化和产生前神经组织和视网膜细胞的能力[3]。Mariani等[4]指出，3D培养技术为体外培养感光细胞带来了希望，使视网膜类器官生产感光细胞的效率和稳定性得到了极大地提高。本文就3D培养技术在视网膜类器官培养中的应用、视网膜类器官移植存在的问题、视网膜类器官与临床应用的距离等展开综述。

1 3D培养技术在视网膜类器官培养中的应用

1.1 小鼠胚胎干细胞来源的视网膜类器官研究表明，小鼠胚胎干细胞衍生来的视网膜组织具有类似于人类视网膜的顶端-基底极性[5]，顶端突起随后内陷，从而形成视杯。目前，从胚胎干细胞培养自体3D视网膜类器官的方法多基于Yoshiki Sasai团队的方案：将鼠胚胎干细胞以每孔3000个接种于96孔板中使其形成胚状体，并在无血清培养基中加入细胞外基质使其形成连续的神经上皮。在继续培养1周以后，鼠胚胎干细胞可形成视泡样结构并表达Rx、Pax6等转录因子[6]。其中，60%的视泡样结构在前3 d向内凹陷形成双层细胞壁的视杯结构，分离后可单独发育成视网膜层——光感受器细胞层、外核层、内核层和神经节细胞层。并且随着类器官培养时间至数月时，可以产生多种细胞类型，包括感光细胞前体细胞以及包含外节的成熟感光细胞。Yoshiki Sasai及其同事开创的方案是一种允许细胞自我组织形成视泡或视杯结构的方案。

在体内，从视泡到视杯的形成是由一个复杂的信号系统调控的，如在鼠间脑外翻导致视泡形成后，视泡中可表达骨形态发生蛋白4、成纤维细胞生长因子8和Delta等信号因子，这些信号因子诱导表皮外胚叶的细胞分化为晶状体板。而晶状体板形成后分泌的成纤维细胞生长因子反作用于视泡，诱导视泡表达Vsx2。Vsx2是视网膜形成的必需因子。同时，晶状体板与其对应区域的视泡远端部分同时内陷，最终其内部发育成视网膜神经上皮层，外部发育成RPE层[7]。但是在实际培养中，通过体外培养得到的视网膜类器官虽然能表达成纤维细胞生长因子，但不具有外胚层。因此，体外培养获得的视泡内陷会受阻，最终无法发育成视网膜神经上皮层。这一现象说明视网膜神经上皮层的发育可能是相对独立的。

3D培养技术首次提供了在体外生产大量视网膜感光细胞的可行性，这在2D培养技术中是无法实现的[8]。Yoshiki Sasai的方案虽然打破了2D培养技术的瓶颈，但是由于不同多能干细胞系之间存在的高度异质性限制了其应用。视杆细胞和视锥细胞都是视网膜中捕获光信号的重要组成部分。有研究在Yoshiki Sasai方案的基础上通过增加可移植光感受器的数量对培养技术进行了调整。他们通过模拟延长视网膜组织在母体器官内的生长时间以获得更多的视杆细胞[9]。与此同时，有学者使用类似方法培养了视网膜类器官，并对视杆细胞进行标记，然后将其移植到有视网膜退行性疾病的小鼠模型上。经定量分析发现，在移植后10 d时，尽管没有形成视泡或视杯结构，但是已经出现了神经上皮并有具有分层结构的细胞向各层视网膜迁移发育。因此，经典的Yoshiki Sasai方案中分离视杯有可能会导致潜在感光细胞的损失。此后，还有学者对培养技术进行了调整，其选择在10 d将视网膜类器官平均分成三等分后继续培养，并且在不同发育阶段，即移植后的12～14 d和16～18 d，抑制DAPT的信号转导，从而达到分别使视锥和视杆细胞生成增多的效果。另外，一些研究发现在视网膜类器官发育的不同阶段，适当地添加营养和增高氧浓度也可以提高感光细胞的存活率[10]。总之，视网膜类器官3D培养技术的引入，为人们了解视网膜正常发育和变性过程提供了实验依据。

1.2 人胚胎干细胞来源的视网膜类器官小鼠胚胎干细胞分化成视网膜类器官的3D培养技术为使用hESCs和hiPSCs生产视网膜类器官细胞提供了更多的可能性。为进一步探索hESCs用于视网膜分化方案的可行性，Yoshiki Sasai团队在2012年提供了一种从人类胚胎干细胞3D转分化视网膜组织的方案。该方案可生成典型的三层视网膜结构，包含视网膜神经元细胞、神经胶质细胞和光感受器[11]。哺乳动物的眼球是在发育过程中间脑外翻而产生的，发育需要协同抑制特定的信号通路如Wnt/BMP通路等，同时激活特定通路如IGF通路等。所以，这一方案的主要特征是在快速聚集的胚胎干细胞中加入基质胶，并及时添加Hedgehog激动剂和Wnt激动剂以实现包含视网膜神经上皮层和RPE层的视杯的形成。这是目前唯一一个可以形成双层视杯结构的方案。研究显示，Wnt/catenin信号通路对形成RPE层相关基因(包括MitF和Otx2)的调节十分重要[12]，70%的细胞在移植后18 d有Wnt/catenin信号通路的激活，随后表达感光标记蛋白如视蛋白、视杆和视锥细胞特异性蛋白等。如今已有研究团队将这一方案的改良版应用于临床研究，并取得了一定的进展[13]。

此外，还有其他学者也提出了能将人类胚胎干细胞转化为视网膜组织细胞的新方法。该方案将细胞在漂浮条件下用神经诱导培养基培养，细胞贴壁后发育成柱状的神经上皮。随后观察并检测移植后神经上皮的情况，研究发现，在移植后6 d即可检测到视觉相关基因转录物(Rx、Six3、Six6、Lhx2、Otx2和Pax6等)的生成；在移植后10 d时超过90%的细胞是Pax6/Rx表达双阳性，同时DKK-1和noggin等视觉相关蛋白表达都上调；在移植后25 d时可明显区分视泡样视网膜神经球和前脑神经球结构。此外，有约17%血源性hiPSCs经此方案诱导产生的视泡显示出一定程度的分层，可观察到视网膜神经节细胞在最内层，光感受器样细胞在最外层[14]。随着研究的深入，此方案被继续改进。在改进方案中，细胞贴壁在基质胶包被后的孔板上，添加胎牛血清、维甲酸和牛磺酸可促进光感受器细胞的分化。研究发现，在移植后21～28 d视网膜中Chx10表达阳性视网膜祖细胞比例可高达70%；在移植后5 周可观察到视网膜生成，同时视网膜神经节细胞Brn3蛋白阳性表达；移植后22周左右，出现Chx10表达阳性的双极细胞[15]。添加维甲酸的培养基促进了光感受器细胞的发育和成熟，产生了更多的Rho、S-视蛋白和L/M-视蛋白表达阳性的光感受器细胞，同时这些光感受器细胞也表达其他视觉相关蛋白[16]。

3D培养技术的引入极大地增加了人视网膜组织和人光感受器细胞的获取途径，但分化过程的异质性和漫长的培养周期仍是问题。多能干细胞具有无方向聚集的特点，这一特点是导致分化过程中出现异质性的主要原因之一[17]。因此，一些实验室开始在聚集成团的培养物中分化hESCs，将其中小块的hESCs放置在基质胶中，5 d内可以形成包含单个腔和顶端-基底端极性结构的神经上皮组织[18]。这种改良方案能强有力地诱导细胞分化成为视网膜组织细胞，能在不需要选择和分离色素集落的情况下产生RPE细胞，并有效形成包含分层的视网膜组织，但是这一方案目前仍缺乏足够的定量分析证据。

基于人多能胚胎干细胞(hPSCs)的视网膜分化方案的出现为发育研究、疾病模型以及临床应用提供了更切合实际的方法[19]。此方案一方面催生了更多关于早期人类视网膜细胞形成过程的研究，另一方面使得探究早期视网膜发育过程中关键转录因子的作用和在体外模拟跟踪视网膜疾病的发生发展变得更加容易[20]。视网膜类器官技术可以产生大量临床相关的视网膜细胞群用于移植或高通量筛选。视网膜类器官细胞中未分化的细胞极少，避免了多轮细胞分选，降低了移植后畸胎瘤形成的可能性[21]。另外，利用生物反应器增加类器官细胞适应性可大量增加其产出，在不久的将来完全可以满足基于细胞治疗或药物筛选对高细胞数的要求。然而，视网膜类器官在多大程度上再现了体内发育，以及视网膜疾病是否可以在体外完全模拟仍需进一步评估。

1.3 鼠源和人源视网膜类器官的差异由小鼠和人类胚胎干细胞分化成视网膜祖细胞需要的条件不同，小鼠胚胎干细胞来源于囊胚内的细胞团，而人类胚胎干细胞来源于稍晚的外胚形成阶段[22]。与鼠源胚胎干细胞不同，人源胚胎干细胞的再聚集是缓慢且不完全的，这一特点会导致各部分分化效率不同[23]。同时人源胚胎干细胞分化需要更高浓度的血清，在体外视网膜分化过程中，人类胚胎干细胞衍生的视网膜类器官细胞在形态上需要更长的发育时间[24]。在视网膜分化和成熟的后期，物种差异则更明显。人类体内视网膜发生始于视网膜中央凹的位置，密集地填充着小鼠视网膜中不存在的视锥细胞，然后在数周或数月后扩散穿过视网膜到达视网膜边缘。因此中心区域发育良好后，周边区域的视网膜祖细胞可能刚刚结束细胞分裂周期。目前尚不清楚人类视网膜类器官是否能够在体外重现视网膜中央凹的形成，且与鼠源相比，人源视网膜类器官中视锥细胞比例更高[25]。实际上，由于视锥细胞对人类视觉的重要性，已有不少研究尝试增加视锥细胞在鼠源类器官组织中的占比，例如在不同的发育阶段抑制Notch信号从而增加视锥细胞的数量。总之，尽管视网膜类器官细胞的培养依靠相同的原理，但是物种差异的存在使得异种动物的研究成果无法及时转化。不过由于培养时间显著缩短，小鼠视网膜类器官细胞在基础研究中仍然是研究哺乳动物类器官发育有价值的替代工具[26]。

2 视网膜类器官移植存在的问题

有效稳定的细胞来源、移植后细胞能够长期存活、能够实现体内成熟、恢复与现有视网膜通路的连接以及丧失的视觉功能，是光感受器细胞移植成为治疗视网膜退行性疾病的必要条件[27]。尽管过去数年间的研究使得光感受器类器官移植离临床应用更进一步，但仍有些条件尚未被完全满足。用原代小鼠视杆细胞进行的研究开创了光感受器细胞移植的新方法，在视杆细胞生成的高峰期从视网膜类器官中分离出供体细胞时，可获得最佳的移植效果。在首次使用鼠胚胎干细胞的研究中也观察到了供体细胞年龄和分化阶段对移植成功率的影响，证实了移植光感受器前体可以提高移植成功率。根据观察，移植发育早期的移植物更容易形成完整的移植后组织结构，同时流式细胞仪分选技术也证明了这一点。但是，需要注意的是将光感受器移植到仍然含有内源性光感受器的视网膜后，移植物和宿主之间发生了包括荧光报告蛋白在内的细胞质物质交换[28]，这对应用流式细胞分选技术判断移植成功率的准确性提出了质疑，目前还需要寻找更准确的方法进行评估。

供体光感受器和宿主神经元之间建立突触联系是移植成功的一大基本特征。通过检测供体光感受器和宿主二级神经元突触前和突触后终末的突触蛋白以及通过微电极阵列和视觉行为学测试评估在移植区的视网膜神经节细胞水平可以记录到光响应信号，这说明供体光感受器和宿主神经元之间可以建立突触联系[29]。但是，在临床前视网膜退行性疾病动物模型中评估人体光感受器细胞的功能，仍然需要建立更有说服力的实验数据来证明人体光感受器细胞和小鼠二级神经元之间存在正确的突触连接。

视网膜处于免疫赦免状态，但是在临床前动物模型中使用人光感受器细胞时，炎症仍可能对移植物的存活和继续分化成熟产生重要影响[30]。研究发现，将hESC来源的视网膜细胞移植到IL2RG缺乏的免疫缺陷鼠中或使用免疫抑制剂可以得到更高的移植存活率和更佳的整合效果。为了充分了解免疫系统在光感受器细胞移植中的作用，需要进行更多的系统研究，这些研究将对临床应用意义重大。

3 视网膜类器官与临床应用的距离

如今，有几种专为视网膜退行性疾病量身定做的治疗方法正在进行临床试验。1997年，学者们进行了首例人光感受器细胞移植的研究，当时两名患有晚期视网膜色素变性的失明患者接受了从成人眼中获得的明胶包裹的光感受器细胞薄片。在移植后12 个月未出现视力改善，但也没有出现免疫排斥反应。1999年，首次报道视网膜色素变性患者接受胎儿的视网膜移植后视力改善且无免疫排斥反应[31]。然而，由于胎儿视网膜的可获得性极低，这类研究样本量极少。因此，使用hESCs和hPSCs培养视网膜细胞以及生成RPE和光感受器细胞的相关研究为克服供体视网膜组织数量限制提供了解决方案。

事实上，由hPSCs和hESCs高效生成RPE的方案已经在Stargardt病和老年黄斑变性患者中启动了第一批临床试验，MA09-hRPE细胞系是第一个进入临床试验的细胞系。由于hESCs是在丝裂霉素C处理的成纤维细胞上扩增的，因此由其生成的人RPE细胞被认为是异种移植产品。这些用于治疗视网膜退行性疾病的开创性细胞移植疗法试验结果表明，由多能干细胞衍生来的RPE细胞移植是安全的，无重大副作用，而且移植后能够避免患者视力进一步损失。针对特定患者的个性化多能干细胞方案将是避免移植细胞免疫排斥的理想选择，然而它们可能需要使用CRISPR/Cas9等基因编辑工具进行基因改造，以敲除致病突变防止反复发病[32]。虽然这样做增加了治疗成本，但干细胞可以大量扩增和分化，一个细胞系可以用于多个患者。

多能干细胞衍生的光感受器类器官已经迈出临床应用的第一步。现存挑战除了细胞系和随代数变化的高度异质性之外，还有生产包含光感受器细胞的3D视网膜类器官繁琐的人工操作步骤(例如上述的神经视网膜/视杯分离)。此外，最重要的是要在移植前从异质视网膜器官中富集得到人类视锥细胞和视杆细胞前体，以提高移植成功率和增加手术的安全性，从而排除治疗后患者畸胎瘤的形成。

4 前景及展望

人类胚胎干细胞或人工诱导的多能干细胞可以为临床应用提供足够的人源视网膜细胞，还能为研究人类相关发育和疾病提供更多思路和手段。随着视网膜类器官3D培养技术的发展，在体外产生视网膜组织的技术已经越来越成熟，并且还在不停地发展完善中。事实上，视网膜类器官3D培养技术是目前最先进的体外大量生产光感受器细胞技术，而视网膜类器官3D培养技术的使用进一步提高了用于研究特定靶组织和细胞分化及成熟的体外模型建模的成功率。然而，细胞系之间的高度异质性、冗长的培养时间以及费时费力的程序，还有缺少纯化特定光感受器亚型的分选技术，限制了人类视网膜类器官在临床应用中的开展。如果能够克服这些挑战，视网膜类器官3D培养技术将成为治疗目前无法治愈的视网膜退行性疾病的重要手段。