自噬在蒽环类化疗药物心脏毒性中的作用研究进展

任昌振综述 刘科卫审校

近年来，有效的抗癌疗法极大地改善了恶性肿瘤患者的生存和预后，但也导致了多种心血管并发症的发生[1]。蒽环类药物(anthracyclines,AC)是一类在临床上广泛应用的高效广谱抗肿瘤药物，至今仍是治疗多种恶性肿瘤的基础化疗药物之一[2]。然而，AC可导致剂量依赖性和不可逆的心脏毒性，这成为其临床应用的最大阻碍。目前，人们对蒽环类药物诱导的心脏毒性(anthracyclines-induced cardiotoxicity,AIC)机制进行了大量的基础研究，但仍缺乏有效的预防和治疗手段。自噬(autophagy)是一种进化保守的细胞吞噬过程[3]，越来越多的研究证实其参与了AIC的发生。然而，自噬在AIC中的作用仍然存在争议，激活或抑制这一过程对AIC患者是否有益并没有明确的共识。现综述AIC的分类和机制，重点关注自噬在AIC发生、发展中的作用并讨论以调控自噬作为AIC防治靶点的潜在价值。

1 AIC概述

1.1 AIC的定义及分类 目前，根据我国“蒽环类化疗药物心脏毒性防治指南(2013年版)”，AIC的定义指具有以下1项或多项表现：(1)左心室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)降低的心肌病，表现为心脏整体功能的下降或室间隔运动的明显降低；(2)充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF)相关的症状，如胸闷、心悸、呼吸困难等；(3)CHF相关的体征，如第三心音奔马律、心动过速等；(4)LVEF较基线值降低>5%且绝对值<55%，伴有CHF的症状或体征；或LVEF较基线值降低>10%且绝对值<55%，不伴有CHF的症状或体征[4]。

按照出现的时间分类，AIC可分为急性、慢性和迟发性心脏毒性：(1)急性心脏毒性发生率较低，往往出现在AC化疗的数小时或数天内，对心脏造成的损伤通常是可逆的，最常见的临床表现为心脏传导系统的紊乱和心律失常，如复极化和QT间期改变、室性或室上性心律失常等，少数患者可表现为急性冠状动脉综合征、急性心力衰竭、心包炎及心肌炎等；(2)慢性心脏毒性常以累积剂量依赖性的形式发生，常出现于AC化疗终止1年内，其心脏损伤常被认为是不可逆的，临床表现为无症状的收缩和/或舒张性左心室功能不全，并逐渐发展为严重的心力衰竭；(3)迟发性心脏毒性常于AC化疗终止1年后出现，并可持续数年甚至数十年，表现为心力衰竭、心肌病及心律失常等[2]。

1.2 AIC的发生机制 迄今为止，导致AIC的具体机制仍未完全明确。现有的大多数证据表明，活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生是AC引起心肌细胞损伤的主要原因。2014年，拓扑异构酶(topoisomerase,Top)2β被证实在AIC的发生中至关重要[5]。Top2β可在DNA复制、转录或重组过程中解开DNA链。AC通过抑制Top2β的活性引起线粒体功能障碍，并导致细胞凋亡途径的激活和ROS的累积[5]。此外，铁离子代谢紊乱、钙超载、心脏炎性反应、DNA损伤应答等机制也与AIC的发生和发展密切相关[6]。在过去的十年中，随着肿瘤心脏病学的蓬勃发展，以防治AIC为目的的不同策略被不断开发，包括使用各种抗氧化剂，旨在阻断AC相关的氧化应激。然而，尽管这些药物在实验动物模型中被证明是成功的，但它们并没有显示出显著的临床获益[7]。抗氧化剂临床试验的失败表明，除氧化应激外，AIC的发生可能还存在其他重要机制。近年来，自噬作为心肌细胞生存的重要过程，在AIC发生中的作用受到了关注。

2 自噬概述

2.1 自噬的概念和分类 自噬是在1963年由Christian de Duve教授在电镜下观察到细胞存在“自己吃自己”的现象后，而提出的一种用来描述细胞在溶酶体内消化胞内物质的过程。自噬是一种在真核细胞中进化高度保守的细胞生物学机制，近年来因其在心脏生理和病理中的重要作用而得到越来越多的关注。在多种心血管疾病(如心脏缺血再灌注损伤、心肌肥厚、扩张性心肌病、心力衰竭等)的发生发展过程中都证实存在自噬功能的异常[8]。换言之，自噬是在细胞受到应激刺激后，为维持细胞内稳态，将受损的细胞器、错误折叠或聚集的蛋白质及外来病原体等运送至溶酶体降解清除的过程。

根据细胞内降解底物传递到溶酶体方式的不同，自噬主要分为3种类型：巨自噬(macroautophagy)、微自噬(microautophagy)和伴侣介导的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)[9]。巨自噬是自噬中最常见的类型，其特征是形成一种独特的称为自噬小体的双层膜细胞器，将细胞内物质运送至溶酶体内降解；微自噬是指溶酶体通过溶酶体膜的内陷直接吞噬细胞内物质的过程；而伴侣介导的自噬，其特征是含有KFERQ序列的蛋白与伴侣蛋白(如热休克蛋白70等)结合，后者以溶酶体相关膜蛋白2A依赖的方式将靶蛋白运输到溶酶体降解的过程[10]。自噬曾被认为是一种非选择性的过程，但近年来研究发现，自噬也可以选择性地降解细胞内物质，如受损的线粒体、核糖体、内质网、溶酶体、过氧化物酶体等细胞器及细胞内的异源物质如微生物等。因此，根据选择性降解底物的不同，自噬又可分为：线粒体自噬(mitophagy)、核糖体自噬(ribophagy)、内质网自噬(reticulophagy)、溶酶体自噬(lysophagy)、过氧化物酶体自噬(pexophagy)和异源自噬(xenophagy)等[11]。

2.2 自噬的生物学过程和调控机制 巨自噬是细胞响应环境和生理信号的主要调控形式，也是自噬过程中最具特征性的表现形式。在本文中重点关注巨自噬(以下简称自噬)的形成过程。自噬发生的过程涉及复杂的膜动力学，实质是亚细胞膜重新排列的过程。自噬的步骤可以分为自噬小体的起始、延伸、形成、成熟和降解5个关键阶段。在膜重排的过程中，会形成具有独特双膜结构的囊泡，将部分细胞质和细胞器隔离，称为自噬小体。随后，自噬小体与溶酶体融合，形成自噬溶酶体，并利用其中一系列溶酶体降解酶(如组织蛋白酶和其他酸性水解酶)对隔离的物质进行蛋白质水解。消化后的内容物被重新释放到胞质中，在生物合成途径中进行循环再利用。

自噬过程中的调控机制是十分复杂的，涉及多个由进化保守的自噬相关基因(autophagy-related genes,ATG)编码的蛋白质与其他自噬调节因子的协调作用。迄今为止，已鉴定出至少40个以上的ATG参与了自噬不同阶段的调节。在这些ATG中，有18个基因(ATG1～ATG10,ATG12～ATG14,ATG16～ATG18,ATG29和ATG31)编码的蛋白是自噬小体形成所必需的，被称为自噬核心基因[12]。ATG蛋白家族在自噬不同阶段与其他自噬调节因子的相互作用，主要是通过蛋白质水解和蛋白质翻译后修饰实现的，包括磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化、乙酰化和脂化等[13]。例如，在哺乳动物中，由ATG13与丝氨酸—苏氨酸激酶Unc-51-line激酶1(ULK1)和200 kD复合物的黏着斑激酶家族相互作用蛋白(FIP200)共同形成的复合物，是自噬启动所必需的[14]。而由ATG3、ATG4、ATG7、ATG10和ATG16参与形成的ATG12-ATG5和微管相关蛋白轻链3(light chain 3,LC3)—磷脂酰乙醇胺2个泛素样偶联系统，在自噬小体的延伸及形成阶段发挥重要作用[15]。此外，自噬也同时受到许多其他信号通路和介质的调控，其中腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路构成了自噬的调节核心通路[16-17]。大量研究表明，AMPK和mTOR信号通路分别发挥促进和抑制自噬的作用。其中mTOR主要受磷酸肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR通路的上游信号调控[18]。更具体地说，细胞内或细胞外应激可以激活PI3K受体，进一步催化磷脂酰肌醇4,5-二磷酸转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3)。在与磷酸肌苷依赖性激酶1的共同作用下，PIP3进一步激活Akt。被激活的Akt会上调mTOR活性，后者通过使ULK1失活进而抑制自噬的启动[18]。相反，当机体缺乏营养或能量时，一磷酸腺苷(AMP)/ATP比值的增加可以激活AMPK，从而抑制mTOR的活性，削弱其对ULK1的抑制作用，最终启动自噬[17]。mTOR作为自噬调控的传感器，接收来自不同上游信号分子的信息，进而调控下游信号分子，包括p70S6K、ULK1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(PGC-1α)等，发挥各自的生物学效应[19-20]。因此，mTOR活性的绝对增减是由各种因素或刺激的比例决定的。自噬调控可能涉及mTOR的同时激活和抑制，这取决于哪种调节因子占主导地位。

2.3 自噬的生物学功能 自噬作为一种严格调控的分解代谢过程，介导细胞内物质的降解和循环，对维持体内稳态和细胞生存发育至关重要。例如，神经细胞中ATG基因的缺失会导致神经退行性变和泛素阳性聚集物的积累，而ATG基因在肝脏中的缺失则会导致肝肿大和肝功能障碍[21-22]。正常情况下，大多数细胞发生较低的基础水平自噬，清除受损和多余的细胞器、错误折叠的蛋白质和入侵的病原体。而在缺氧、饥饿和氧化应激等恶劣条件下，自噬过程被认为是一种内源性防御机制，使细胞的生存能力增强[23]。自噬增强的转基因小鼠在心脏和肾脏纤维化及自发肿瘤发生等表型方面有明显改善，并且可以比正常小鼠存活得更长[24-25]。在线虫中的研究证明，自噬通路对大多数长寿状态(如热量限制)是必不可少的[23]。自噬可能通过改善蛋白质和细胞器质量控制、促进基因组稳定性等方面来促进长寿。除了对细胞生存的促进作用，自噬还可以调节多种细胞通路，包括肿瘤的抑制和促进、炎性反应和免疫反应等[26]。虽然基础水平的自噬对维持细胞内环境稳定是必要的，但当自噬过度激活并超过一定阈值时，就会导致一种特殊类型的细胞程序性死亡，又被称为细胞的自噬性死亡(autosis)[27]。

3 自噬在AIC中的作用

心脏自噬在AIC中的作用一直存在争议。一些研究发现AC化疗诱导自噬，进而加剧心脏毒性，而其他研究表明自噬具有保护和预防AIC的作用。现总结关于AC调控自噬研究中相互矛盾的观点，并讨论这些矛盾结论的可能原因。

3.1 AC过度激活自噬导致AIC发生 目前大多数学者认为，AIC的发生是由于AC治疗中过度激活了心肌细胞的自噬过程，形成了过多的自噬溶酶体，导致心肌细胞在降解受损细胞器和胞内错误折叠蛋白的同时，损伤了细胞内正常的物质，引起心肌细胞自噬性死亡，并进一步介导了心脏重塑。早期多项国内外关于AIC的研究为这一理论提供了支持。2009年，Lu等[28]首次报道了AC能够刺激自噬标志物Beclin1(酵母菌ATG6的同源物)的生成，并通过电镜观察到心肌自噬小体数目的增多。黄洁等[29]也通过构建AIC模型发现AIC模型组小鼠心肌组织内的Beclin1和LC3-Ⅱ(自噬小体形成的另一个关键标志物)水平较对照组明显增加。Kobayashi等[30]通过构建Beclin1过表达模型，发现Beclin1过表达后可进一步加剧AC诱导的心肌细胞死亡，而抑制Beclin1蛋白可阻断自噬激活并减少AC导致的心肌细胞死亡。基于这种理论，吴昂等[31]发现自噬抑制剂氯喹可以提高不同浓度AC作用下心肌细胞的存活率，并推测可能与其抑制了Beclin1的表达水平有关。后来进一步的研究又发现，除了Beclin1和LC3-Ⅱ外，AC治疗还可导致心肌细胞内其他多个不同自噬相关标志物的高表达，如ATG5、ATG7、p62等[32-35]。安慧仙等[36]在探寻AIC保护药物的研究中发现，能够通过抑制自噬减轻AC的心脏毒性。总的来说，这些研究指出自噬的激活是AC引起心肌细胞程序性死亡的主要原因，并根据这一观点，提出抑制自噬可能是防止AIC发生的一种有效手段。

3.2 AC抑制自噬功能导致AIC发生 有学者提出了与上述相反的观点，认为AC治疗过程中自噬相关标志物的升高是自噬被抑制后出现的累积效应，本质是AC破坏了心脏自噬流的动态平衡，导致心肌细胞对外界环境刺激的保护机制受损，同时细胞对自身衰老细胞器和错误折叠蛋白的处理能力下降，使已经形成的自噬小体不能够被有效及时降解而产生堆积，从而触发了心肌细胞凋亡，并逐步发展为AIC。研究发现，AC能够抑制自噬启动的上游正调控因子AMPK的磷酸化，提示AC可通过抑制自噬的启动来降低自噬水平，而通过预先饥饿处理启动自噬后再给予AC干预，发现可恢复细胞AMPK信号传导和心脏自噬水平，并减轻了AC诱导的心脏收缩功能障碍[37]。基于这一理论，Sishi等[38]通过应用自噬诱导剂雷帕霉素对AC处理后的大鼠心肌细胞进行干预，发现雷帕霉素激动自噬后反而明显降低了AC的毒性，提高了心肌细胞活力。与此同时，其他研究也发现在AC处理后心肌自噬被抑制，LC3和p62会积累性增加[39-40]。这些研究与先前的结论截然相反，为自噬在AIC中的作用带来了新的视野。近期另一项研究又进一步对AC引起的自噬通量改变进行了动态观察和分析，提出可能是由于AC抑制了溶酶体上H+-ATP酶活性，进而导致溶酶体酸化受损，使自噬小体与溶酶体融合受阻而不能降解底物，从而引起Beclin1、LC3-Ⅱ和p62等自噬标志物的堆积[41]。因此，AC除了抑制自噬启动外，似乎还影响自噬的后续步骤，如底物的降解。最近一项旨在筛选AIC保护药物的研究中，通过构建AIC斑马鱼模型，也证实了AC对心脏自噬的抑制作用，而恢复自噬则能改善心脏功能[42]。综上，这些研究从各个方面显示出AC对自噬功能的抑制和破坏，并提出自噬通量的修正可以减轻AC引起的心脏损伤。

3.3 自噬在AIC中作用存疑的可能原因分析 AC是否增加或抑制自噬及自噬在AIC中是否有益仍存在争议。目前的这些基础研究得出了完全对立的结论，综合分析可能存在以下原因。首先，在模型的构建方面，使用不同种属的动物模型、体内和体外模型及急性和慢性模型，都可能导致结论的不同。在这方面，哺乳动物整体层面的慢性低剂量AC毒性模型更接近临床情况，得出的结论可能也相对更为可靠。其次，评价自噬功能的时间点和检测手段的不同也可能导致不同的结果。如前所述，自噬是一个动态降解胞内物质再利用的循环过程，不同时间点的取材也许仅能发现自噬在某一阶段的变化。而相较于检测自噬标志物如LC3-Ⅱ、Beclin1、p62等蛋白水平变化的传统方法，通过应用RFP-GFP-LC3双荧光腺病毒转染直接动态观察自噬流的手段则更为精准[43]。此外，有些研究没有进行自噬通量的分析，在这种情况下，简单观察自噬标志物的表达水平变化可能会导致错误的结论。最后，回归到自噬的本身，生理水平的自噬是保护性的，而过度激活的自噬可能是损伤性的。因此，在肿瘤存在的复杂背景下，自噬在AIC中也可能发挥双重作用，这可能取决于自噬激活的水平及自噬与其他生理和病理过程之间的相互作用。最近的一项研究通过对AIC斑马鱼模型及小鼠模型进行表型分析，发现自噬在AIC中存在一种双相反应：早期激活，后期抑制。该研究进一步证实，基于ATG7(编码限速自噬核心蛋白)的自噬激活在AIC的后期能够产生心脏保护作用，而在早期激活自噬则会加剧AC的心脏毒性，这在一定程度上凸显了靶向自噬治疗的时间依赖性特点[44]。

4 小结与展望

越来越多的证据表明，自噬在心脏生理和病理过程中起着重要的作用。与此同时，自噬也已经成为一种很有前景的癌症治疗靶点。目前临床广泛使用的AC改变了癌细胞和/或心肌细胞的自噬水平，使得自噬在AIC中起着重要作用。然而，心脏疾病体内、体外模型的局限性和复杂性一直困扰着这一领域，导致文献中充满了相互矛盾的结果。自噬在AIC中是激活还是抑制、激活或抑制自噬后AIC如何发展、如何靶向调控自噬预防AIC的发生，这些问题都有待于进行更广泛的研究来证实。阐明自噬这一生物学过程在AIC中的作用将有助于预防或治疗化疗引起的心脏毒性。此外，未来靶向自噬的抗肿瘤药物的研发还需要警惕心脏毒性的发生，特别是与其他已知影响自噬水平的药物联合使用时，更要加强对心脏功能的监测。随着生物信息学的不断发展，必须利用最先进的实验策略来确定自噬通量在化疗应激心肌细胞中的功能作用。更为严格的自噬检测和评价方案，对于阐明这些复杂的生物学问题，以实现提高临床疗效和减少心脏毒性发生至关重要。