维生素D对特发性肺纤维化Ⅱ型肺泡上皮作用的研究进展

赵宁 曹大伟 张新日

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种不可逆转的肺纤维化疾病，男性较女性多发，常见于50岁以上人群，平均预期生存时间3-5年，目前认为Ⅱ型肺泡上皮细胞(type 2 alveolar epithelial cells，AT2)的反复损伤是IPF的起始事件。AT2是维持肺泡结构和功能的关键细胞，反复损伤致其功能异常及衰老凋亡，引发上皮-成纤维细胞的异常互动，诱导成纤维细胞灶形成和大量细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积[1-2]。目前对IPF尚无令人满意的治疗方法，因此研究相关治疗药物迫在眉睫。文献报道维生素D可以抑制AT2衰老凋亡、抑制纤维化相关通路和AT2上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition，EMT)延缓肺纤维化进展，有望成为IPF辅助治疗药物,本文就维生素D对IPF中AT2作用的研究进展作一综述。

AT2衰老凋亡驱动IPF

肺泡由AT2和Ⅰ型肺泡上皮细胞(type 1 alveolar epithelial cells，AT1)组成。AT1是鳞状上皮细胞，覆盖在大部分肺泡表面，形成肺泡上皮屏障，其薄片形状便于附近的毛细血管网与外界进行气血交换。除了分泌表面活性物质维持肺泡形态，AT2还增生分化为AT1，维持肺泡上皮屏障的完整性。既往认为IPF为慢性炎症疾病，但抗炎治疗并未抑制疾病进展，许多证据表明AT2在IPF的发病机制中起着核心作用。

内在因素(遗传、年老)和外在因素(吸烟、病毒感染)均可引起AT2损伤并影响祖细胞功能，导致低效的再上皮化，造成基底膜和间质暴露，并通过旁分泌的方式引发上皮-成纤维细胞异常互动，导致成纤维细胞过度激活和分化，造成大量ECM沉积和肺结构破坏[1-2]。在IPF患者肺组织中，异常AT2常位于成纤维细胞灶附近，成纤维细胞灶是分泌大量ECM的成纤维细胞和肌成纤维细胞簇，为IPF的典型病理特征之一[1]。

AT1受损后，AT2会自我复制并分化为AT1，但反复损伤引起的持续的AT2增生分化，会导致端粒变短，加速细胞衰老。当AT2无法分化再生成正常肺泡上皮并产生足够的表面活性蛋白时，肺内机械张力随即升高，引起AT2继发性损伤，加剧了上皮细胞耗竭并激活AT2胞内TGF-β 信号，形成恶性循环，加速肺纤维化进展[3]。因此反复的AT2损伤最终引起细胞衰老凋亡，实验表明肺纤维化小鼠肺部AT2数目减少，这种重要祖细胞的耗竭，不仅造成肺泡修复再生能力大幅下降，也预示着纤维化的发生[4]。细胞衰老凋亡是维持组织稳态所必需的，但也可在病理状况下被过度激活，Kim等[5]向健康小鼠肺部重复灌注凋亡的自体AT2引起肺纤维化，体内外实验证实巨噬细胞摄取凋亡的AT2后会向促纤维化表型转换。Yao等[6]发现从IPF患者分离的AT2呈衰老状态，并通过构建Sin3a基因敲除的小鼠模型，证明了p53和p21诱导的AT2衰老与肺纤维化的因果关系，而且抗衰老药，达沙替尼和槲皮素对衰老AT2的干预抑制了纤维化发生。综上，AT2衰老凋亡在IPF发生过程中有重要作用，阻断相关通路是有希望的IPF治疗方法。

维生素D的生物学作用

维生素D是一种主要由皮肤合成或从食物摄取的脂溶性维生素，先后经位于肝肾的羟化酶羟化为活性最强的1,25-(OH)2D3。1,25-(OH)2D3与维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)结合后同视黄醇X受体形成异源二聚体，该复合物与靶基因启动子区内维生素D反应元件结合调控细胞基因转录。维生素D主要功能是调节钙磷稳态和骨代谢，近期研究表明还有抗感染、抗炎、抗纤维化作用[7]。维生素D缺乏是世界性难题，美国内分泌学会定义血清25-(OH)2D3<20 ng/mL为维生素D缺乏，缺乏阳光照射和饮食摄入不足是维生素D缺乏的主要原因。维生素D促进AT2成熟，出生时维生素D缺乏是新生儿呼吸窘迫综合征和支气管肺发育不良发生的危险因素[8]。Zheng等[9]发现维生素D减轻肺泡上皮损伤，促进AT2增殖并抑制其凋亡。相关研究认为肺纤维化与维生素D缺乏有关，Vasilios Tzilas等[10]通过检测93名IPF患者血清25(OH)2D3浓度发现，维生素D缺乏普遍存在，且与患者肺功能指标及死亡率密切相关，表明维生素D水平有成为IPF预后标志物的潜力。

维生素D抑制AT2衰老凋亡

AT2有一套质量控制系统来应对内外界压力，该系统失效会引起细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)、线粒体功能障碍、端粒损耗等，最终引导AT2衰老凋亡，导致肺部稳态丧失，促进肺纤维化发生[1-2]。研究发现维生素D可以调控以上过程延缓AT2衰老凋亡。

一、维生素D与ERS

蛋白折叠和质量控制异常是衰老的主要特征，内质网折叠功能失调造成未折叠或折叠错误的蛋白大量堆积，该现象称作ERS。细胞随即调节PERK、ATF6、IRE1α三种跨膜蛋白的活性来维持蛋白稳态，若ERS持续存在则会诱导细胞衰老凋亡[11]。研究表明疱疹病毒、吸烟、年老、基因突变均可诱发肺泡上皮细胞出现ERS，且ERS标志物ATF4和CHOP等，在IPF患者AT2表达增加[12]。家族性IPF患者AT2细胞SFTPC基因突变引起大量错误折叠的表面活性蛋白C堆积于内质网，最终引起细胞凋亡。小鼠AT2细胞SFTPC基因C121G突变引起ERS和随后的自发性肺纤维化，暗示ERS可能是疾病的早期驱动因素[13]。老年小鼠和IPF患者的AT2细胞中GRP78减少，GRP78是ER伴侣蛋白，调节内质网稳态抑制ERS，敲除小鼠GRP78基因后进行表型分析发现，AT2中衰老标志p53和p21、ERS标志CHOP和凋亡标志裂解的caspase-3增加。实验揭示了GRP78缺失，诱导ERS发生，进而引起AT2细胞功能障碍和衰老凋亡，造成肺纤维化[14]。因此ERS诱导AT2衰老凋亡，在IPF发生过程中有重要作用。

维生素D在一定程度上抑制ERS，维持蛋白稳态。秀丽隐杆线虫是衰老研究的模型动物，蛋白稳态丧失和不溶蛋白积聚参与其衰老，维生素D可以减少不溶蛋白积聚提升蛋白稳态，延长秀丽隐杆线虫寿命[15]。ERS诱导剂衣霉素处理VDR敲除小鼠，持续的ERS造成肝脏细胞凋亡和炎性因子大量释放，但野生型小鼠VDR的激活却减少了ERS标志物ATF6、ATF4和CHOP等在胞核周围的积聚，因此VDR信号在调节ERS中有重要作用[16]。

二、维生素D与端粒

端粒是一段位于染色体末端的DNA-蛋白质复合体，保护染色体末端DNA序列免于降解和重组。每次DNA复制都造成端粒缩短，端粒过短会触发DNA损伤反应，引起细胞衰老或凋亡。Snetselaar等[17]发现IPF患者肺部AT2细胞的端粒长度明显变短，且端粒缩短与IPF患者存活率降低相关，在家族性和散发性IPF患者中均发现了有关调节端粒长度的基因变异，如TERC、TERT和RTEL1等。研究发现，泛素连接酶FBW7介导了BLM诱导的小鼠肺纤维化，AT2细胞内活性增加的FBW7促进端粒保护蛋白TPP1降解，触发端粒去帽化，引起端粒缩短及DNA损伤反应、G2/M期细胞周期停滞和随后的AT2细胞衰老，最终导致小鼠肺纤维化[18]。

白细胞端粒长度(leukocyte telomere length，LTL)已成为临床研究端粒长度的替代物，Newton等观察到LTL<10th的IPF患者FVC下降较快，即LTL缩短与IPF病情进展有关，因此LTL有望作为IPF患者预后标志物[19]。Julia等[20]对不同年龄段的人群进行研究发现，40～59岁的参与者血清25(OH)2D3浓度与LTL呈正相关。一项横断面研究发现维生素D充足个体的相对LTL比维生素D缺乏者的长，这可能与维生素D抗氧化作用有关[21]。但这些横向研究不均匀，无法得出结论性的发现。Mohsen Mazidi等[22]用双样本孟德尔随机化方法分析二者关系发现，血清25(OH)2D3浓度和端粒长度无关，目前二者关系仍存在争论，需要更多研究来阐明。

三、维生素D与线粒体功能障碍

线粒体稳态主要由线粒体自噬、线粒体融合分裂和线粒体生物合成来调节。AT2因自身代谢需求有较多线粒体，线粒体作为氧化呼吸的主要场所，其功能障碍造成大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，给胞内DNA、蛋白质和脂质带来巨大的氧化压力，其中线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)缺乏组蛋白保护，更易受到ROS影响，造成异常mtDNA从受损线粒体释放，引起细胞衰老凋亡[23]。由此可见，线粒体ROS生成和mtDNA损伤可能是肺泡上皮细胞衰老凋亡的重要原因之一，而且血清mtDNA升高也提示IPF患者预后不良[24]。当功能障碍的线粒体无法启动自噬时，ROS生成和mtDNA损伤诱导细胞凋亡。因此自噬相关因子的水平异常被认为参与了IPF的发病过程。作为促线粒体自噬因子，PTEN诱导激酶1 (PTEN-induced putative kinase 1，PINK1)缺乏是引起IPF患者AT2中功能障碍的线粒体自噬不足的重要原因。研究发现化学制剂诱导A594细胞出现ERS，抑制了PINK1启动子活性导致其表达降低，随即去极化线粒体堆积引起大量ROS生成[25]。氧化应激诱导小鼠AT2细胞内PINK1缺乏，并且PINK1基因敲除小鼠的AT2细胞的mtDNA损伤更剧烈，迫使AT2凋亡，使该小鼠较野生型更易出现肺纤维化[26]。因此，线粒体功能障碍及自噬不足可以诱导肺泡上皮细胞衰老凋亡增加肺纤维化易感性，在IPF的发病过程中扮演了重要角色。

VDR沉默引发呼吸爆发导致了ROS过量生成，对线粒体稳态和细胞存活造成了不利影响，揭示了VDR防止过度呼吸活动和限制ROS产生的新作用[27]。叔丁基过氧化氢诱导C2C12肌肉细胞产生过多ROS及线粒体结构和形态变化，1,25-(OH)2D3抑制了这一过程[28]，意味着维持线粒体的正常功能需要维生素D。维生素D会促进抗氧化物质生成来拮抗ROS，1,25-(OH)2D3通过上调Nrf2减少ROS生成和DNA损伤，抑制p53/p21和p16/Rb通路来延缓细胞衰老[29]。除了抗氧化，维生素D还激活APMK/mTOR途径促进线粒体自噬减轻乙醇诱导的肝细胞损伤，有利于清除功能障碍的线粒体和抑制细胞衰老凋亡[30]。综上，维生素D可以通过维持线粒体稳态来抑制细胞衰老凋亡，但是目前关于线粒体功能障碍与维生素D的报道较少，仍需进一步研究。

维生素D与纤维化介质

除了祖细胞能力受损，AT2还向衰老相关分泌表型转变。AT2和其他细胞释放的大量介质以自分泌或旁分泌方式塑造促纤维化微环境，诱导肺泡上皮细胞衰老凋亡，成纤维细胞增殖分化和EMT发生，参与肺纤维化形成[31]。

一、维生素D与TGF-β1

TGF-β1是促纤维化的强力因子，与其他因子联动促进EMT、AT2衰老凋亡、成纤维细胞分化及ECM沉积。IPF患者肺部TGF-β1升高，主要由AT2和肺泡巨噬细胞等分泌。TGF-β1与胞膜上的I、Ⅱ型受体结合使Smad2与Smad3磷酸化，与胞浆内的Smad4结合形成Smad2/3/4复合体，进入核内调节相应基因转录[32]。RanaT.等[33]发现TGF-β1激活p16/pRb通路诱导AT2衰老和分泌大量纤维化介质。此外，衰老的AT2表达整合素αvβ6，激活TGF-β1促进纤维化。因此TGF-β1在肺纤维化过程中发挥重要作用。

维生素D抑制肺纤维化的作用与TGF-β1/Smad通路有关。Li团队[34]发现维生素D缺乏小鼠和Cyp27b1基因敲除小鼠经BLM处理后肺部TGF-β/Smad2/3通路较对照组明显激活，且纤维化程度加重，说明维生素D缺乏放大了TGF-β/Smad信号通路。Smad7是TGF-β/Smad通路的抑制剂，维生素D减少Smad3表达并上调Smad7抑制纤维化[35]。除此之外，TGF-β1刺激下的人支气管成纤维细胞表现出很强的致纤维化能力。1,25-(OH)2D3显著抑制了该效应，并通过阻滞细胞周期来抑制TGF-β1诱导的人支气管成纤维细胞增殖[36]。以上研究表明维生素D有作为肺纤维化辅助治疗药物的潜力。

二、维生素D与局部血管紧张素系统

局部血管紧张素系统(renin angiotensin system，RAS)参与了肺纤维化，矽肺大鼠模型肺组织中血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)表达升高，SiO2处理的成纤维细胞血管紧张素II ～1型受体(Angiotensin II type 1 receptors，AT1R)表达增加[37]。血管紧张素II(Angiotensin II，AngII)与AT1R结合诱导肺泡上皮细胞凋亡，并激活MAPK和Smads通路，促进TGF-β1等促纤维因子表达及胶原蛋白沉积引起肺纤维化[38-39]。而且大量动物实验证明ARB和ACEI类药物有减轻肺纤维化的作用。以上均说明RAS在肺纤维化中扮演重要角色。

维生素D是RAS的负性调节剂，骨化三醇调节ACE/ACE2平衡，抑制RAS过度表达，延缓肾脏纤维化进展[40]。长期缺乏维生素D的小鼠肺泡结构破坏甚至塌陷，肺泡间隔变厚呈纤维化表现，且肺部ACE / Ang II / AT1R轴过度表达，即维生素D缺乏诱导RAS失衡，引发纤维化级联反应导致小鼠肺纤维化[41]。

维生素D与EMT

EMT是上皮细胞丧失极性和细胞间紧密连接转化为具有间质细胞特性的过程。TGF-β/Smad与wnt/β-catenin等多种通路，激活调节转录因子，抑制上皮细胞标志物E-cadherin转录,增加间质细胞标志物转录，使细胞形态改变并获得迁移侵袭能力[42]。持续的微小损伤诱导肺泡上皮细胞释放大量因子招募活化肌成纤维细胞，AT2上皮间质转化是肌成纤维细胞的来源之一[1, 43]。

TGF-β与Wnt通路在组织修复过程中诱导AT2上皮间质转化，维生素D通过抑制TGF-β经典途径阻止EMT[9]。FZDs与LRP5/6形成的跨膜受体和Wnt结合抑制β-catenin降解，使其堆积于胞内并向细胞核转位。胞核内，β-catenin 与TCF/LEF结合调节特定基因转录。维生素D对wnt/β-catenin通路的作用在结直肠癌中研究较多[44]：(1)1,25-(OH)2D3与核VDR结合后诱导β-catenin/VDR复合物形成阻止β-catenin与TCF/LEF结合；(2)1,25-(OH)2D3促进CDH1基因产物E-cadherin表达，E-cadherin 会把β-catenin固定在细胞间黏附连接阻止其核转位；(3)1,25-(OH)2D3促进wnt抑制剂DKK1表达。上述维生素D拮抗wnt的机制对肺纤维化研究有一定借鉴之处，Sari等发现[35]维生素D增加了经香烟烟雾提取物和TGF-β处理的A549细胞中DKK1表达，降低了p-Smad2/3、Smad4与β-catenin的水平，阻止其调节EMT靶基因转录，使E-cadherin免于降解，最终抑制实验组A549细胞向间质细胞转化。因此，适当补充维生素D可以抑制EMT，延缓纤维化进展。

展 望

维生素D是人体必需的维生素，众多研究发现维生素D抑制AT2衰老凋亡、拮抗肺纤维化。因此，适当补充维生素D可延缓IPF进展，有望成为IPF辅助治疗药物。未来应通过大样本、前瞻性及对照研究，探讨合适剂量及治疗时长。