生物标志物用于鉴别诊断肺结节性质的研究进展

杜孝敬 马礼兵

孤立性肺结节(solitary pulmonary nodule，SPN)是直径≤3cm，肺内孤立存在的，圆形或者类圆形的非透明病灶，结节是完全由肺实质所包围，没有肺门或纵隔淋巴结肿大、肺不张及胸腔积液[1]。随着胸部CT在临床实践中的日益普及，越来越多的人被发现孤立性肺结节。美国国家肺部筛查试验(NLST)表明，采用低剂量CT对高危人群肺癌的筛查可降低死亡率[2]。然而，低剂量CT缺乏区分早期恶性肿瘤和良性结节的准确性，导致假阳性率很高(96.4%)[2-3]。近年来氟代脱氧葡萄糖(18F-flurodeoxyglucose,18F-FDG)PET/CT用于孤立性肺结节的鉴别诊断，其诊断价值得到了广泛的认可[4]；研究显示[5-6]，对于直径>8mm的孤立性肺结节，最大标准摄取值(SUVmax)用于诊断孤立性肺结节得到了极大的肯定,但对于直径较小的孤立性肺结节，其诊断性能仍没有较多的文献数据支持。现国内外手术及介入处置的时机仍没有很好的评判标准，依靠多学科协作诊疗可能是目前最适宜的方式。一项研究显示，在肺癌患者中，细针抽吸活检样本的质量或数量往往很低，高达25%的活检无法获得足够的组织进行评估[7]。一些肿瘤标志物包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、癌胚抗原(CEA)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)和细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)已被广泛应用于临床。但是，这些肿瘤标志物对于区分良恶性肺结节的特异性和敏感性是有限的。且影像学检查往往具有滞后性以及放射线辐射危害。因此，这证明有必要探索新的诊断工具，例如生物标志物，作为鉴别孤立性肺结节性质的非侵入性方法。

生物标志物

一、肺癌七种自身抗体标记物

肿瘤抗原可以启动宿主免疫应答，产生与肿瘤抗原相关自身抗体，这些抗体已被发现在疾病出现症状之前就已存在[8-9]。因此，对于早期肺癌的检测具有诊断价值[10]。研究表明，自身抗体用于区分良恶性肺结节时，其敏感性为56.53%，特异性为91.60%，当与CT结合时，特异性可以进一步提高到95.80%[11]。ChapmanC.J.等人[12]首次将肺癌七种自身抗体联合用于肺癌的检测, 单项抗体检测的阳性率为5%～36%，特异性为96% ～100%，而联合检测阳性率76%，特异性为92%。一项国内大规模、多中心性研究，肺癌七种自身抗体抑癌基因53(P53)、蛋白基因产物9.5(PGP9.5)、性别决定基因家族2(SOX2)、肿瘤/睾丸抗原G抗原7(GAGE7)、ATP结合RNA解旋酶(GBU4-5)、黑色素瘤抗原A1(MAGEA1)、肿瘤相关基因(CAGE)用于肺癌早期的诊断，其敏感性为61%，特异性为90%，同时也验证了与单独使用 CT 扫描相比，联合使用，可使诊断肺结节的准确率提高到 89.1%[13]。一项Logistic回归研究显示，在早期肺癌中，这七个自身抗体的组合检测比任何单个自身抗体的检测更可靠(敏感性：47.8%；特异性：81.4%)[14]。一项系统性回顾分析，也证明了测定血清或血浆中的自身抗体可用于早期肺癌检测的生物标志物[15]。目前有研究提出，痰液中的自身抗体的敏感性可能比血清或血浆中自身抗体的敏感性高，更加利于早期肺癌的检测。Li N.等人的一项研究中开发了痰液中自身抗体(DDX6、ENO1和14-3-3ζ)作为生物标志物，其诊断肺癌的敏感性为81%，特异性为83%，可用于检测早期肺癌，但其诊断价值及临床意义后续需要更多的研究来验证[16]。可见肺癌七种自身抗体标记物作为一种新兴的生物标志物用于孤立性肺结节和早期肺癌的鉴别，具有一定的临床应用价值。

二、DNA甲基化

DNA甲基化是多种生物学过程和疾病中的主要表观遗传修饰之一，特别是在肿瘤的发生过程中[17]。DNA甲基化的改变通常发生在癌症的早期阶段[18]。近年来，随着DNA甲基化的分析技术和临床转化研究的突破，DNA甲基化检测可以作为一种早期筛查和诊断肿瘤的新技术。一项基于矮小同源盒(SHOX2)基因、前列腺素E受体(PTGER4)基因DNA甲基化与传统肿瘤标志物(NSE、CEA、CYFRA21-1)对良性和恶性肺结节的鉴别诊断研究，SHOX2、PTGER4和总甲基化的曲线下面积(AUC)远高于传统的血清标志物，其诊断性能优于传统的血清参数[19]。LiM.[20]等联合了三个甲基化标记，即cg08032924(CMTM2)、cg14823851(TBX4)和cg19161124(DPP6)，得出了这三种标记物在区分肺腺癌和正常组织样本方面可以达到极高的敏感性和特异性，并且这三个标志物在I期肿瘤中均显着超甲基化(Mann-WhitneyP值<0.0001)。在最近一项欧洲和中国肺癌病例对照研究中，结合6个甲基化标记物的血液检测(Lung EpiCheck)，其能检测到高比例的早期肺癌，并在加入已确定的危险因素(年龄、吸烟、慢性阻塞性肺疾病等)后显著提高了预测的准确性[21]。因此，DNA甲基化这种非侵袭性的检查方法，展现了良好的应用前景。

三、循环肿瘤DNA

循环肿瘤DNA(ctDNA)是坏死的肿瘤细胞释放到血液中的DNA[22]。近年来，随着基因测序技术的快速发展，ctDNA得到了广泛的关注。许多研究似乎对ctDNA在治疗监测方面特别有吸引力，而在早期癌症诊断和筛查方面的潜力，才刚刚开始探索。ctDNA作为肿瘤晚期的生物标记物的价值已经得到很好的证实[23]。但是，其在早期肺癌检测中的价值仍未确定[24]。有研究显示，与传统的组织活检相比，血液中ctDNA对肺癌的诊断敏感性可达到75%，特异性达到89%[25]。此结果表明，在早期肺癌患者的血液中检测突变的ctDNA是有可能性的。尽管ctDNA分析为早期肺癌诊断提供了可行的选择，但现有技术对敏感性分析的困难仍难以克服。而开发下一代测序(NGS)技术可能会提高这方面的敏感性。ctDNA对癌症早期诊断的潜力是一个值得关注的领域，在应用于临床之前，还需要进一步的技术开发和更大规模的循证研究。

四、循环肿瘤细胞

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是从原发肿瘤或转移瘤中分离出来进入外周血的肿瘤细胞。在过去的二十年里，无论是在局部还是在转移的情况下，CTC的预后价值已经在最常见的肿瘤类型中得到了明确的证明[26]。然而，它们在对恶性肿瘤的诊断作用仍有待确定，尤其是对恶性肿瘤的早期鉴别作用。几项研究已经在肠癌、前列腺癌等恶性肿瘤发展的早期阶段发现了CTC[27-29]。而CTC用于诊断早期肺癌相关研究也有显著发现。2014年Ilie等人报道称[30]，在患有慢性阻塞性肺疾病的肺癌患者中，利用上皮肿瘤细胞大小分离技术(ISET)检测CTC的存在，发现CTC比在CT扫描中发现恶性肿瘤的放射征兆早1～4年。而近期的一项前瞻性、多中心队列关于使用ISET技术的检测CTC在肺癌筛查的研究中得出，CTC检测对肺癌检测的敏感性为23.6%[31]。这可能与早期肺癌患者血液中CTC的数量少有关。另外，有研究首次利用CellCollector技术检测体内CTC对早期肺癌诊断的敏感性和特异性分别为52.94%和90%，用CTC计数区分良恶性结节的ROC曲线下面积为0.715 (P=0.041)[32]。结果表明，体内捕获的CTC可用于早期肺癌的有效诊断。然而，既往使用CellSearch系统诊断早期肺癌的研究显示，体外捕获的CTC不能有效区分良恶性结节[33]。这一结果可能是体外检测技术灵敏度低的结果。目前，CTC用于早期肺癌筛查的证据仍不足，随着更好的CTC分离技术的发展和大型前瞻性试验中的临床测试，CTC的临床效用有望提高。

五、微小RNA(miRNA)

血浆miRNA在肺癌的发生和发展过程中起着关键作用[34]。许多研究表明，miRNA对早期癌症检测具有很高的诊断效率[35-36]。在两个大型的意大利回顾性研究中，使用miRNA特征分类器(MSC)和miR-Test可以使低剂量CT假阳性率降低四到五倍，而特异性(75%～81%)和敏感性(78%～87%)相当[37-38]。且相比于单个miRNA，多个miRNA组合诊断效率更高[39]。研究显示，早期非小细胞肺癌患者中miRNA-146a、-200b和-7的表达水平明显高于良性结节患者，并使用这三个miRNA和CT特征建立了早期非小细胞肺癌的预测模型，敏感性和特异性分别为92.9%、83.3%，表明这三个miRNA可能是肺癌早期诊断的潜在生物标志物[40]。也有一些基于痰液miRNA的研究为诊断恶性肺结节带来新希望，XieY.等首次证明内源性miRNA具有抗冻融作用，并且稳定存在于痰液中[41]。一项研究提出，痰液中miRs-21、31和210这三种miRNA生物标志物，可以区分早期非小细胞肺癌与良性孤立性肺结节，敏感性为82.93%，特异性为87.84%[42]。最近的一项研究显示，联合痰液和血浆miRNA检测比单独使用时具有更高的准确性，体现了不同体液中的生物标志物将协同改善非小细胞肺癌的早期检测，但目前这项研究尚无来自小细胞肺癌患者的标本，生物标记物对早期检测小细胞肺癌的诊断潜力仍然未知[43]。针对恶性程度较高的小细胞肺癌来说，可能更应该结合多种方式进行前瞻性的研究。

展望与总结

生物标志物的发现为肺结节患者带来了新希望。肺癌七种自身抗体标记物、DNA甲基化、循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞、miRNA等这些标志物作为一种快速、方便且无创的方法，未来广泛应用于临床，帮助临床医生以个性化的方式管理患者。联合临床、生物学和放射学等多学科协助鉴别孤立性肺结节的性质，提高早期肺癌诊断的特异性和敏感性，从而实现对肺癌的早发现、早治疗，并最终改善肺癌的预后。