宏基因组二代测序技术在感染性疾病诊断中的应用价值

马 慧,沈永明,司 萍

(天津市儿童医院 天津大学儿童医院检验科，天津 300134)

目前，感染性疾病仍然是全世界人类发病率和死亡率的主要原因。其致病原类型多样，除常见病原体外，罕见细菌、病毒、真菌及寄生虫等病原体不易被检测，给临床诊断带来困难。快速准确地诊断病因病原体可能是一项挑战，因为各种各样的微生物可能导致临床上难以区分的疾病，而目前的方法可检测病原体的光谱相对较窄。因此，由于病原体的多样性，传统检测手段的局限性，以及临床医生对目标病原体的判断水平参差不齐，在临床上超过2/3的感染性疾病最终仍无法鉴定其病原体，导致临床不能针对性地用药，经验试错情况时有发生。这一困境在临床重症感染性疾病，特别是由疑难、罕见的病原体导致的临床重症型病例上尤其严峻[1-2]。

宏基因组二代测序(mNGS)是基于高通量测序技术以及生物信息学分析对病原体进行基因测序的临床实验室诊断技术[3-4]，是一种不依赖于分离培养的新兴病原体检测技术。以其不需培养、鉴定速度快、准确率高等优点逐步应用于感染性疾病领域。截至目前，该技术是临床应用最广泛的病原体高通量测序技术，对临床患者感染病原体的早发现和精准治疗有着极其重要的作用。但就现阶段而言，受限于高昂成本，mNGS 主要集中应用于重大疾病、突发公共卫生事件和特定病例人群，目前尚未纳入常规临床检测[2]。本文就其在感染性疾病诊断中的应用价值及其优势进行综述。

1 mNGS在不同器官系统感染性疾病中的应用

1.1血流感染：血流感染(BSI)是危重患者常见的危及生命的并发症，通常导致感染性休克和死亡。为了获得最佳治疗效果，目前的指南建议尽早开始广谱抗菌治疗，最好在败血症/感染性休克识别后1 h内开始。然而在实际临床实践中，大约46%的经验性抗生素治疗被证明是不合适的，导致死亡率增加35%，增加了抗生素耐药性和毒性的风险。因此，快速准确地检测BSI病原体对于指导早期抗菌治疗、实现更好的抗生素管理以及进一步改善临床结果非常有价值。目前，血培养结合抗菌药物敏感性测试(AST)仍然是BSI诊断的金标准。然而，血液培养受到周转时间长、敏感性相对较低的限制(因为之前使用抗生素导致微生物接种量低或生长抑制) ，以及低特异性。近年来，mNGS在疑似BSI患者的病原体检测中显示了巨大的潜力。mNGS不需要培养，可以分析临床样本中的整个微生物群落[5]。早期的研究已经表明，mNGS与脓毒症患者血液培养试验的诊断一致性高达93.7%，其结果与其他直接分子诊断方法的结果相当或优于，表明mNGS有可能识别多种感染，包括各种病因引起的血液感染[6]。mNGS的总体诊断敏感性明显高于单独使用的细菌培养，同时对培养阴性脓毒症病例提供了更好的结果。

综上所述，在血液感染的诊断和治疗指导方面，mNGS与基于培养的方法相比具有不可否认的优势，因为无论微生物类型如何，它都能将病原体鉴定所需的时间显著缩短到24小时以下，且受抗生素影响较小[7]。

1.2中枢神经系统感染：各种病原微生物可感染中枢神经系统(CNS)，表现为脑膜炎、脑炎和脓肿，通常威胁生命；早诊断、早治疗是临床亟待解决的关键问题。目前临床使用的主要病原学检测方法灵敏度较低、时效性差，不能满足临床需要，导致患者无法得到早期诊断及精确用药。因此，迫切需要及时准确的诊断方法，近年来，mNGS显示了其优越性。近几年应用 mNGS从患者脑脊液中诊断出腮腺炎病毒、EB病毒、布氏杆菌、李斯特菌、结核分支杆菌、福氏奈格菌、创伤弧菌、脑囊虫相关的脑炎或者脑膜炎的案例相继见诸报道[8]。还有报道称从CNS感染疑诊患者的脑组织中检测出人类疱疹病毒和麻疹病毒[8]。mNGS辅助诊断CNS感染的作用越来越受到重视。此外，mNGS也被证明在诊断亚急性或慢性脑膜炎方面、在鉴定培养阴性和未诊断病例中存在的复杂和罕见病原体方面有价值。事实上，除了具有相当高的诊断性能外，mNGS还可能有助于指导CNS感染的更具针对性的治疗。然而，尽管与传统方法相比，mNGS的总体检出率更高，但它不能取代传统方法，如培养。相反，建议将mNGS与传统微生物检测结合使用，以提高中枢神经系统感染的致病性诊断[9]。此外，在采集CNS样本之前，mNGS结果受抗生素使用的影响较小，因此，在抗生素使用严重影响患者致病微生物检测的情况下，该技术优于其他方法。

1.3呼吸道感染：呼吸道感染目前仍是高发病率及高死亡率的疾病，其病原体的诊断非常重要，传统病原学检测方法诊断能力不足问题日益突出。随着mNGS的发展与成熟，该技术有望成为帮助指导靶向治疗和抗生素合理应用的有效工具。目前国内的实验室对于常见细菌诊断技术相对成熟,但对一些少见的细菌感染,比如结核分枝杆菌、诺卡菌、非结核分枝杆菌、各种放线菌、厌氧菌,诊断能力尚有不足[10]。mNGS可以相对快速、准确地检测和识别多种病原体，有助于及时、准确地治疗肺部感染，特别是对危重病患者和混合感染患者。此外,使用mNGS也被证明可以提高肺部侵袭性真菌的诊断感染。此外，在免疫功能低下患者的分析中，mNGS的检测准确率甚至可能达到100%。mNGS目前是病毒发现的首选方法，特别是对于新出现的肺炎病毒(即SARS-CoV、MERS-CoV和H7N9)，并且可能有助于追踪和控制疫情[11]。

1.4骨和关节感染(BJI)：骨关节感染在临床上较为常见，尤其是骨科内植物相关感染如假体周围感染或骨折内相关性感染是临床医生面临的巨大挑战，尽管医学水平不断提高，但仍有许多骨关节感染患者最终因感染导致关节功能受限、生活质量下降和残疾。目前传统的微生物培养仍然是大多数医院的主要诊断方法，但常规培养存在敏感度相对较低和费时等缺点。近年来，分子诊断已被应用于BJI的诊断。这些技术独立于培养的方法，目前PCR是一种普遍接受的病原体鉴定方法，敏感度有所提升，但无法识别真菌和多微生物混合感染。

滑液、外植体(即人工关节和其他矫形设备)的超声液以及假体周围组织均可通过mNGS来识别致病病原体。然而，迄今为止的研究主要集中在特定类型的样品上，如超声波液体或滑液。很少有队列研究报告调查mNGS检测BJI患者不同类型样本病原体的能力。骨关节感染时，经常无法获得充分的关节液样本，而组织样本较容易获取。常规的分子诊断手段多数需要采用关节液样本提取病原体核酸以避免组织样本中人员核酸污染的干扰，mNGS的技术特点无此方面限制[12]。另外， 国内外一些报道发现与常规培养相比，mNGS拥有更高的病原体检出率，mNGS不仅可以检测到所有常规培养阳性病原体的序列数，还能从常规培养阴性的样本中检测到病原体序列数[13-14]。mNGS的另一优势是可以检出混合感染，但也存在一定的局限性。其检出的病原体无法确定是定植菌、背景菌或致病菌，对于病原体存活状态也无法确定，还需要结合临床表现和优化培养结果进行精准诊断[12]。此外，非结核分枝杆菌(NTM)骨关节感染的病原检出率和报道近年逐渐增多。薛白等[13]报道在骨关节感染患者中，mNGS对骨关节结核而言，优势不明显。其原因可能与送检样本的不同类型有关。为增加研究结果的可靠性，未来应持续开展大样本的、多中心的研究。

综上所述，对于培养阴性BJI、通过关节腔穿刺获得的样本量有限或患者对经验性抗生素治疗或清创反应不佳的情况，应强烈建议使用mNGS[15]。

1.5尿路感染(UTI)：UTI是一种常见的社区获得性感染，通常由细菌以及某些真菌或病毒引起。大肠杆菌(≈75%)是简单和复杂UTI最常见的病原体，后者由复杂的致病微生物组成，这使得诊断病原体相当困难。抗生素治疗通常是UTI患者的优先治疗策略，然而，由于最近严重的抗生素滥用，病原体对抗生素的耐药性显著增加，进一步增加了疾病负担[16]。因此，快速、准确地鉴定UTI的病原体，进而优化药物治疗至关重要。UTI诊断的金标准仍然是定量尿培养。然而，细菌的标准实验室定量尿液培养通常至少需要18 h，这表明发病后24～48 h内诊断可能存在困难[17]。此外，由于许多病毒和寄生虫传统上难以培养或不可能培养，因此可以通过检测特定抗原、抗体或基因的血清学和分子方法进行诊断。然而，临床医生的事先判断对于诊断仍然是重要和必要的[18]。mNGS能够比培养方法更快、更敏感地识别病原体，无需临床前预测或培养，这进一步促进了准确诊断和最佳治疗。

1.6消化系统感染：主要的肠道病原菌种类包括来自外部环境的侵入性肠道病原菌和来自共生肠道的病原菌。由于肠道通常由共生细菌定植，粪便样本的mNGS主要集中在非细菌物种，例如轮状病毒A、隐孢子虫和人类帕雷乔病毒，这些病毒通常在发热儿童的粪便样本中检测到。mNGS也被用于检测急性胆囊炎患者的潜在病原体，筛查是否存在罕见病毒，或识别急性肝衰竭患者的合并感染。除了病原体识别外，mNGS也是一种快速和不可知的诊断方法，用于研究耐药体，并可用于识别肠道中的抗生素耐药基因(ARG)，帮助检测多药耐药菌(MDROs)，从而导致早期实施感染预防实践、抗菌优化和预防侵袭性感染[19]。

2 总结

mNGS不仅可以快速检测和全面识别细菌、真菌、病毒、寄生虫、支原体和钩端螺旋体等，而无需事先推定致病者。而且病原体可以直接从各种临床标本(血液、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、胸水、腹水、脓液和组织标本)中识别，具有更高的灵敏度和准确性，优于基于培养的方法，尤其是对于分枝杆菌、厌氧菌、非典型病原体和病毒。此外，mNGS受先前抗生素暴露的影响较小[9]。因此，mNGS在传染病诊断和鉴别诊断方面显示出巨大潜力。但目前该技术只能检测到细菌属水平，不能检测到种水平及提供相应的细菌药敏实验。检出的病原体尚无法判断是否为致病菌及是否存活。希望在未来的研究中能够解决这个问题。