唑草酮对斑马鱼和非洲爪蟾的急性毒性评价*

廖朝选，李 俊，魏 杰，宋光林▲，龙安禄

(1贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550014；2贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550002)

农药是为人们守护作物生长和粮食安全的重要帮手，没有农药，粮食安全无从谈起[1]。然而，农药在实际使用过程中，仅有少部分作用于靶标生物，仍有大量的农药进入环境，对生态系统产生破坏[2-3]。据报道，在我国重要的小麦、玉米和水稻产区，土壤即农产品中均存在多种农药残留[4]。我国新疆沙雅县不同植物类型农田环境中部分区域处于中等风险，六六六、毒死蜱、氯氟氰菊酯、氟胺氰菊酯、甲霜灵、苯醚甲环唑和腐霉利是主要的残留农药[5]。江苏省10个市的茶园及表层土壤广泛检出拟除虫菊酯类农药，在全国范围内处于中等水平等[6]。由此可知，农药残留引起风险问题普遍存在，但粮食生产离不开农药使用，此无意的伤害仍将继续，科学合理使用才能趋利避害，将农药的风险降到最低[1]。

唑草酮(Carfentrazone-ethyl)是由美国富美实公司(FMC)开发的三唑啉酮类触杀型除草剂，可在植物叶绿素生物合成过程中抑制原卟啉原氧化酶从而导致有毒中间物的积累，进而破坏杂草的细胞膜，使叶片干枯、死亡[7]。相关产品具有杀草活性高、低温与冲刷耐受性好的特点[8]，在温度较低的环境中具有很大的优势，被登记用于水稻、小麦、甘蔗的一年生阔叶杂草及莎草科杂草防治[9]。目前，对于唑草酮产品的配方筛选[10]、工艺合成[11]方面有了一定的报道，在单剂或复配制剂对小麦、水稻等田间杂草防效方面也有了相当的研究[12-13]，而对于唑草酮施用后的环境生物暴露风险报道较少。科学合理地使用农药离不开产品应用后的环境暴露风险评估，通过室内模拟试验暴露，测试唑草酮对斑马鱼和非洲爪蟾蝌蚪的急性毒性，可为唑草酮的风险评估提供鱼类、两栖类生物的生态毒性基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

电子天平：梅特勒-托利多(中国)有限公司，TLE204E/02，0.0001 g；溶解氧测定仪：美国哈希公司，HQ30d；pH计：上海精密仪器仪表有限公司，PHB-4；鱼缸：一体成型玻璃方缸，体积(V)=8 L。

95%唑草酮原药：江苏瑞东农药有限公司提供；丙酮：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；试验水：经活性炭过滤并脱氯24 h的自来水，pH≈7.2，硬度(以CaCO3计)为173 mg/L，溶解氧为102%ASV(空气饱和值)。

1.2 试验生物

斑马鱼(Brachydaniorerio)：购自上海宏业观赏鱼养殖场，全长2.0～2.5 cm，体重0.12～0.17 g，引入后于实验室预养14 d，试验前7 d的死亡率为0，在试验前已禁食24 h。

非洲爪蟾(Xenopuslaevis)蝌蚪：引自中国科学院生态环境研究中心初孵蝌蚪，引入后于实验室预养3 d，试验前1 d停止进食。

1.3 试验方法

1.3.1 鱼类急性毒性试验

以GB/T 31270.12—2014《化学农药环境安全评价试验准则》第12部分：鱼类急性毒性试验[15]为参考，先用丙酮将95%唑草酮原药制备为100 mg a.i./mL的储备液，然后依次添加入3 L试验水制备为3.00 mg a.i./L、3.60 mg a.i./L、4.32 mg a.i./L、5.18 mg a.i./L、6.22 mg a.i./L、7.46 mg a.i./L和8.96 mg a.i./L的梯度浓度试验液。试验中设置不加任何外源物的空白对照和仅添加丙酮的助溶剂对照(助溶剂浓度为90 μL/L)，每个处理设3个重复，每个重复10尾鱼。试验采用半静态试验法进行，每12 h更换试验液一次，周期96 h，试验中温度保持在24 ℃±1 ℃，光照条件为光暗比16 h∶8 h。

1.3.2 天敌两栖类急性毒性试验

以GB/T 31270.18—2014《化学农药环境安全评价试验准则》第18部分：天敌两栖类急性毒性试验[15]为指导，先用丙酮将95%唑草酮原药制备为200 mg a.i./mL的储备液，然后依次添加入3 L试验水制备为5.50 mg a.i./L、6.60 mg a.i./L、7.92 mg a.i./L、9.50 mg a.i./L、11.40 mg a.i./L和13.69 mg a.i./L的梯度浓度试验液。试验中设置空白对照和助溶剂对照(助溶剂浓度为丙酮，浓度为68.5 μL/L)，每个处理设3个重复，每个重复10尾蝌蚪。试验液制备前先将试验水温调节至25 ℃左右，试验液制备后置于温度24 ℃±1 ℃的大型恒温水浴锅中恒定1 h后放入蝌蚪开始试验。整个试验采用半静态试验法在自然光照条件下进行，每12 h更换试验液一次，周期为96 h。

1.4 数据处理

根据观察的毒性测试结果，采Orgin 2019b进行浓度-死亡情况曲线拟合，采用SPSS 19.0软件统计分析LC50与95%置信限。

2 结果与分析

2.1 毒性效应

鱼类急性毒性试验显示，在唑草酮的影响下，试验鱼不同程度的毒性效应，随浓度增高，症状越明显；而在空白对照和助溶剂对照组中斑马鱼均未发生死亡及其他异常效应，表明了试验系统满足受试生物的正常生长，各处理组发生毒性效应和异常行为与唑草酮有关。在梯度浓度处理组中，3 h后即观察到部分试验鱼频繁换气、进而游动侧翻；6 h后还观察到试验鱼游动侧翻或无法正常游动；12 h后出现试验鱼死亡，部分存活试验鱼体色变深、游动无力；直至试验结束，所有存活斑马鱼均反应迟钝、身体消瘦、体色变黑。

在天敌两栖类毒性试验中，空白对照和助溶剂对照的非洲爪蟾蝌蚪均未发生死亡及中毒症状；各梯度浓度处理组的蝌蚪发生了与斑马鱼相类似的中毒症状和趋势。试验中6 h观察到蝌蚪的游动失调，12 h后出现反应迟钝，24 h开始发生死亡，至试验结束时，所有存活蝌蚪均呈现游动无力症状。

2.2 LC50与毒性等级

如图1所示，斑马鱼和非洲爪蟾蝌蚪分别暴露于不同浓度的唑草酮溶液后，发生了不同程度的死亡现象。在96 h的试验周期里，随暴露时间的增加，死亡率均有所增加；同时随暴露浓度的增加，其死亡率也呈现增加趋势。

图1 95%唑草酮原药对斑马鱼和非洲爪蟾蝌蚪的浓度-死亡率效应曲线

如表1所示，通过SPSS 19.0统计分析，95%唑草酮原药对斑马鱼的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度LC50为6.62 mg a.i./L、5.09 mg a.i./L、4.86 mg a.i./L、4.40 mg a.i./L；对非洲爪蟾蝌蚪的24 h、48 h、72 h、96 h的半致死浓度LC50为14.7 mg a.i./L、10.6 mg a.i./L、7.52 mg a.i./L、7.14 mg a.i./L。

表1 95%唑草酮原药对斑马鱼和非洲爪蟾蝌蚪的毒性试验结果

根据导则[15]规定：农药对鱼类和天敌两栖类的毒性判定均以毒性终点LC50(96 h)确定。当鱼类和天敌两栖类96 h的毒性终点分别为LC50>10、1.0

3 结论与讨论

在实验室条件下，利用半静态试验法测定了95%唑草酮原药对斑马鱼、非洲爪蟾蝌蚪的急性毒性，结果显示，95%唑草酮原药对斑马鱼和非洲爪蟾蝌蚪96 h的LC50分别为4.40 mg a.i./L和7.14 mg a.i./L，毒性等级均为中等，表明了唑草酮对水生生物鱼类和天敌两栖类均有一定毒副作用。唑草酮在田间应用时，不可避免的残留于植物或土壤中，经过土壤淋溶、雨水冲刷等进入水体，当水环境中唑草酮含量达到一定浓度时，可能引起水生生物的毒性效应，进而影响水生态系统。同时，唑草酮大量应用于水稻田的一年生阔叶杂草及莎草科杂草防治[9]，在水稻生产中可能发生田水外溢的情况，农田内高浓度的唑草酮经田水流至河流、湖泊等，可能产生较大风险；而水稻生产期也是天敌两栖类如青蛙、蟾蜍等活跃的时期，田水中大量的唑草酮也对其具有较大风险。因此，在田间应用唑草酮时，应严格按照产品标签使用，加强田间管理，防止田水外溢，同时在天敌两栖类自然保护区域，应避免使用。但是，农药的毒性高，不等于风险高，农药对水生态系统的风险是农药自身理化性质、环境中的行为特性和生态毒性等综合作用的结果。而且急性毒性仅仅可表征短期暴露的毒性效应，而对于长期的生物蓄积、生殖等毒性还缺少相关数据。为了更完善地评估唑草酮对水生生物的暴露风险，还需结合农药环境暴露量与不同周期毒性测试开展进一步的研究。