RP-HPLC法测定克咳胶囊中吗啡含量

文鑫鑫，杨 鑫

(黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556000)

贵州益佰制药的独家产品克咳胶囊处方中包括以下药材：麻黄、罂粟壳、甘草等。以上药材经过酸水煎煮、浓缩浸膏、与细粉混匀等工艺精制而成，具有止咳、定喘、祛痰的功效，临床用于咳嗽、喘急气粗。处方中的罂粟壳的主要有效成分为生物碱吗啡，具有成瘾性。现标准WS3-B-3215-98收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》第十七册[1]，其先行质量标准中无含量测定项，质量可控性差，无法满足生产质控要求。本次实验首次以吗啡为检测指标对克咳胶囊建立高效液相色谱法测定含量，测定15批次止咳胶囊吗啡含量，拟定合理限度范围。按照《中国药典》2020版四部通则[2]进行方法学验证，结果显示该方法操作简单快速，精密度高、重复性好、结果准确，能够有效控制止咳胶囊的产品质量。为止咳胶囊质量标准的提升提供了科学数据支撑。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters e2695高效液相色谱仪，2998 PDA检测器，工作站(Empower3)；梅特勒XPE205，XPR36电子天平；SK8200HP型数控超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇、磷酸(重庆川东化工)，1-庚烷磺酸钠(广东翁江试剂)，磷酸二氢钾(天津科密欧试剂)均为分析纯试剂试药，乙腈为Fisher色谱纯；吗啡对照品购于中检院，批号为171201-201825，供HPLC含量测定时含量为93.6%)，15批样品及缺罂粟壳的阴性样品由贵州益佰制药有限公司提供。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

以辛烷基键合硅胶柱为分析色谱柱，本实验选用Agilent ZORBAX SB-C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流动相：0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液进行等量混合(用磷酸溶液调pH至2.8)87 mL与乙腈13 mL混合；210 nm检测；进样10 μL。

2.2 供试品溶液的制备

取供试品10粒的内容物，混匀，精密称取约0.5 g，置25 mL容量瓶中，加含5%醋酸的20%甲醇溶液约15 mL，摇匀，超声处理30 min(53 kHz，500 W)，放冷至室温，用含5%醋酸的20%甲醇溶液稀释到刻度，摇匀，离心，过滤即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取吗啡对照品适量，加“2.3”项下溶剂溶解并稀释制成最终浓度为每1 mL约含38 μg吗啡的溶液。

2.4 阴性样品溶液制备

取由贵州益佰制药制备的缺罂粟壳的阴性样品按照“2.2”项下方法制备即得。

2.5 专属性实验

分别取上述三种溶液，按照“2.1”项下测定，结果见图1，表明本方法专属性良好，吗啡出峰处无其他峰干扰。

图1 专属性色谱图

2.6 线性关系考察

精密称取吗啡适量(5.232 mg)，置50 mL量瓶中，加“2.2”项下溶剂溶解并稀释至刻度，制得吗啡对照品贮备液(0.097943 mg/mL)。吸取该储备溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL至10 mL容量瓶，用上面相同的溶剂稀释至刻度即得。按照“2.1”项下测定，以峰面积A为纵坐标，吗啡浓度(μg/mL)为横坐标，进行线性回归计算，线性范围为9.7943～58.7658 μg/mL，线性回归方程为：

A=47793.61674C-894.57560，R2=0.99993

将第二点及最后一点的峰面积代入上述回归方程所得浓度与配制浓度相比，相对标准偏差分别为0.00545、0.22%，均相当小，故可认为过原点。可用外标一点法进行含量测定计算。

2.7 精密度试验

取“2.3”项下制备的对照品溶液(浓度为0.039177 mg/mL)，吸取10 μL按照“2.1”下方法重复进样6次，吗啡的平均峰面积RSD为0.26%(远小于2.0%)，说明精密度符合要求。

2.8 重复性试验

分别取克咳胶囊(批号：210212)约0.5 g各6份，精密称定，置于25 mL容量瓶中，按照“2.2”项下方法平行制备得到供试品溶液6份，在“2.1”条件测定，得到6份的平均值为0.505 mg/粒，RSD为1.34%(小于2.0%)，说明重复性符合要求。

2.9 加样回收率试验

精密称取6份已知含量的样品(该批次样品吗啡含量为1.16 mg/g)0.25 g，置25 mL容量瓶中，精密加入对照品溶液(吗啡为0.2109 mg/mL)2 mL，按“2.2”项下方法制备，吸取10 μL在“2.1”条件下进行测定，6份回收率平均值为100.9%，RSD为0.57%，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.10 稳定性试验

取2.8项下的供试品溶液，分别于0 h、1 h、2 h、8 h、16 h、32 h、48 h进样测定吗啡峰面积，RSD为0.16%，说明供试液在48 h内稳定性良好。

2.11 耐用性试验

取同一份对照和供试品溶液在不同仪器不同柱子上进行考察：柱子1：色谱柱，Agilent ZORBAX SB-C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，使用仪器：Waters e2695高效液相色谱仪。柱子2：资生堂色谱柱C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，仪器：赛默飞U3000高效液相色谱仪。柱子3：普宁科技色谱柱C8(5 μm，4.6 mm×250 mm)，使用仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，结果RSD为1.86%，说明该方法耐用性好。

2.12 样品测定

取15批克咳胶囊，按《中国药典》2020版四部通则得到平均装量，按上述方法制备供试品溶液及测定，结果15批样品平均含量为0.516 mg/粒。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

吸取对照和供试品溶液分别注入液相色谱仪，按照上述条件测定。结果表明：对照品吗啡峰的光谱图与供试品中吗啡峰的光谱扫描图基本一致。对照品与供试品吗啡峰的扫描图均在209.6 nm处有最大吸收，且两者峰形也几乎一致，并且达到纯度要求。

3.2 提取方法选择

尝试3种提取方式，分别是方法1：用氨水饱和的氯仿提取，水浴蒸干，甲醇溶解；方法2：含5%醋酸的20%甲醇溶剂超声30 min提取[2]；方法3：含5%醋酸的20%甲醇溶剂水浴回流提取1 h；结果方法1含量0.163 mg/粒，方法2含量0.511 mg/粒，方法3含量为0.524。方法2和方法3含量差不多，但是方法2简单、易操作，故采用方法2。

3.3 流动相及色谱柱的确定

吗啡等生物碱类物质为了能够使其在色谱柱中保留更好，流动相一般要加入离子对试剂，故吗啡HPLC含量测定的流动相从以下3种选择[3]：0.01 mol/L庚烷磺酸钠与0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液等量混合(磷酸溶液调pH至2.8)87 mL与乙腈13 mL混合，乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸钠-0.02 mol/L磷酸氢二钾溶(20∶40∶40)，乙腈-0.1%磷酸(12∶88)(含0.1%庚烷磺酸钠)[3]等，经过摸索，3种流动相比例样品的分离效果都可以，第一种流动相比例下吗啡峰保留时间合适(14 min左右)，色谱峰形好，对称因子合适(0.95～1.05)，故选第一种流动相。

3.4 小结

处方中的罂粟壳所含有效成分吗啡是止咳的有效成分，但是具有成瘾性，该方法操作简便，节约了提取溶剂消耗，加快了提取时间，方法重复性好，结果准确可靠，可用于克咳胶囊中吗啡含量的测定。