一测多评法测定花椒中6种挥发性成分的含量*

周碧云，伍 庆

(贵州师范大学贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001)

花椒(学名：ZanthoxylumbungeanumMaxim.)是指芸香科植物花椒的干燥成熟果皮。花椒作为传统调味品和中药，不仅具有赋味、增香、解腻等作用[1-2]，更具有抗癌、麻醉、镇痛、抑菌、杀虫等功效[3-5]。

受种植地环境影响，各地的花椒品质差异较大，尤其花椒所含有挥发性物质具有不同香味，这些挥发性物质的组合形成花椒的独特香气[6-11]。近年文献对各品种花椒的挥发性物质进行研究，但对其定量方法多数采用面积归一化法，面积归一化法是一种粗略定量、半定量方法，存在结果不够准确，无法准确定量等局限性，在花椒的质量控制上存在一定的限制[12-17]。一测多评法是确定某一成分为内参物，建立其与其他成分的相对校正因子，再通过相对校正因子计算其他成分含量[18-21]。本方法可在只有一种对照品的情况下同时测定多种成分，已被用于多种中药材及食品质量评价中。

本研究选择柠檬烯作为内参物，建立QAMS法同时测定花椒中6种挥发性成分含量方法，该方法简单、可靠、耐用性好，可全面控制花椒的质量，为其质量评判提供一定参考。

1 材料

1.1 仪器与设备

Agilent 7890B、Agilent 6890气相色谱仪(美国Agilent公司)；Agilent HP-5、Agilent HP-1、Agilent DB-5毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，美国Agilent公司)；XS-105 型电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；CH-250 超声波清洗机(北京创新德超声电子研究所)。

1.2 材料与试剂

花椒(分别来源于甘肃、陕西、山西、四川)；柠檬烯(批号：ZHT8J-TG，≥98%)购自东京化成工业株式会社；桉油精(批号：wkq18040410，≥98%)、乙酸芳樟酯(批号：wkq20113004，≥98%)、α-蒎烯(批号：wkq18044081，≥98%)、芳樟醇(批号：wkq19010802，≥98%)均购自四川维克奇生物科技有限公司；β-石竹烯(批号：20200716，≥90%)购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、丙二酸二乙酯等试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 色谱条件

色谱柱：HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；载气：氮气(纯度>99.999%)；氢火焰离子检测器温度：230 ℃；程序升温(初始温度35 ℃，以5 ℃/min升至70 ℃，保持7 min；再以1 ℃/min升至86 ℃，保持2 min；并立即以6 ℃/min 升至140 ℃，再立即以10 ℃/min 升至190 ℃)；进样口温度：240 ℃；进样量：0.2 μL；分流比：50∶1。色谱图见图1。

图1 花椒挥发性成分气相色谱图

2.1.2 内标溶液制备

精密称取内标丙二酸二乙酯适量，加乙醇稀释并定容，配制浓度为27.708 mg/mL的内标储备液。移取内标储备液适量，加乙醇稀释，定容，得到浓度为5.541 6 mg/mL的内标溶液。

2.1.3 标准品溶液制备

分别精密称取α-蒎烯、柠檬烯、桉油精、芳樟醇、乙酸芳樟酯和β-石竹烯适量，加乙醇稀释并定容，配制成浓度分别为0.283 6 mg/mL、11.040 0 mg/mL、1.664 8 mg/mL、3.120 0 mg/mL、0.925 6 mg/mL、0.316 8 mg/mL的混标储备液。精密移取1.25 mL混标储备液于5 mL容量瓶中，加入1 mL内标储备液，乙醇稀释定容至刻度，即得混合标准品溶液。

2.1.4 供试品溶液的制备

将花椒干燥样品进行粉碎，过40目筛，精密称取2.5 g于具塞锥形瓶中，精密移取5 mL内标溶液，称定质量，超声15 min，补重，摇匀，滤过，即得。

2.1.5 线性关系考察

分别精密移取1.00 mL、1.25 mL、2.50 mL、3.50 mL混标储备液于5 mL容量瓶中，再分别加入1 mL内标储备液，乙醇稀释定容至刻度，即得一系列混合标准品溶液。精密移取系列混标溶液，进样测定。以各物质与内标浓度的比值为横坐标(X)，各物质与内标峰面积之比为纵坐标(Y)，进行线性回归。结果见表1，6种成分在各自范围内线性关系良好。

表1 6个挥发性成分回归方程与线性范围

2.1.6 精密度试验

取混合标准品溶液，连续进样6次，记录各成分峰面积，计算RSD值。得出α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇、桉油精、乙酸芳樟酯和β-石竹烯的RSD值分别为1.14%、0.78%、1.61%、1.30%、1.98%和1.85%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 重复性试验

取同一批次花椒粉末样品6份，按“2.1.4”项制备供试品溶液进样分析，计算RSD值。结果α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇、桉油精、乙酸芳樟酯和β-石竹烯的RSD值分别为1.42%、1.52%、1.61%、1.53%、1.80%和1.90%，表明方法重复性良好。

2.1.8 稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h进样分析，记录各成分峰面积，计算RSD值。结果α-蒎烯、柠檬烯、芳樟醇、桉油精、乙酸芳樟酯和β-石竹烯的RSD值分别为1.11%、1.78%、1.90%、1.77%、1.96%和0.97%，表明方法稳定性良好。

2.1.9 加样回收率考察

精密称取已知待测成分含量样品粉末1.25 g于锥形瓶中，共9份，分别加入待测成分含量的50%、100%和150%。按“2.1.4”项制备供试品溶液进样分析，记录各成分峰面积并计算平均加样回收率和RSD值。结果见表2，表明本方法具有良好的回收率。

表2 回收率试验结果(n=9)

2.2 相对校正因子的计算

分别取系列混标溶液，在“2.1.1”项下色谱条件测定，记录各待测成分的峰面积，根据相对校正因子的计算公式fk/m=fk/fm=Wk×Am/(Wm×Ak)[22]，式中Ak为内参物峰面积，Wk为内参物的质量或浓度，Am为待测组分m的峰面积，Wm为待测组分m的质量或浓度，以柠檬烯为内参物，计算其与其他5种挥发性成分的相对校正因子，结果见表3。

表3 5种挥发性成分与柠檬烯的相对校正因子

2.3 耐用性考察

2.3.1 相对校正因子的耐用性

取混合标准品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样测定，计算相对校正因子。考察色谱仪(Agilent 7890B、Agilent 6890)及色谱柱(HP-1、HP-5、DB-5)对相对校正因子的影响。测定结果见表4。

表4 不同仪器和不同色谱柱测得的相对校正因子

2.3.2 色谱峰定位

取混合标准品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样测定，并计算以柠檬烯为内参物，其他挥发性成分的相对保留时间。考察色谱仪(Agilent7890B、Agilent 6890)及色谱柱(HP-1、HP-5、DB-5)对待测组分的相对保留时间的影响。测定结果见表5。

表5 不同仪器色谱柱测得的相对保留时间

2.4 一测多评法与内标法结果比较研究

分别取甘肃、陕西、山西和四川4地花椒，按“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，每个地区花椒制备两份平行供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，分别采用内标法和一测多评法对花椒中的6种挥发性成分含量进行计算，结果见表6。结果表明，两种测定结果之间无显著性差异(P>0.05)。

表6 QAMS与内标法含量测定结果(mg/g，n=2)

3 结论与讨论

QAMS法是确定某一易得、价廉、有效、稳定的成分为内参物，建立其与其他成分的相对校正因子，再通过相对校正因子计算其他成分含量，本方法可在只有一种对照品的低成本情况下同时测定多种成分。本研究发现，柠檬烯和桉油精在花椒的含量均较高且较稳定，并且价格都较为低廉。从样品出峰来看，柠檬烯出峰时间更早，且干扰峰较桉油精更少。因此，根据QAMS法内参物选择原则，本实验选择柠檬烯作为内参物进行QAMS含量测定。

此外，本研究在进行QAMS法与内标法测定花椒6种挥发性成分含量的对比实验之前，考察了不同色谱仪、色谱柱对花椒中建立的6种挥发性成分的相对校正因子和相对保留时间的影响，结果表明相对校正因子和相对保留时间稳定、可靠。而后采用内标法和QAMS法对花椒中6种挥发性成分进行含量测定时，结果表明两种测定结果之间无显著性差异，表明本方法简便、准确，可为花椒提供质量评价方法。