和厚朴酚糖苷化衍生物的合成及防治结肠癌作用机制的预测*

吴兰蝶，党笑笑，李 军，董登祥▲

(1贵州中医药大学药学院，贵州 贵阳 550000；2西安解码生物科技有限公司，陕西 西安 710000)

和厚朴酚(Honokiol，HNK)是一种从木兰属植物的叶和树皮中分离得到的带有烯丙基侧链的联苯二酚类天然化合物，HNK最初是由M.obovata学者[1]从厚朴药材中提取分离得来，且命名的一种白色粉末状酚类化合物。HNK[2]易溶于极性较大或中极性的有机溶剂，难溶于水。虽然近年来学者们研究发现[3-4]，HNK除了拥有传统厚朴药材的功效外，还具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗抑郁、抗肿瘤、肌肉松弛及抗痉挛、保护心脑血管、降低血糖等药理作用。HNK抗肿瘤作用主要表现在抗结肠癌[5-6]，抗肺癌[7-8]，抗膀胱癌[9-10]，抗黑色素瘤[11-12]，抗卵巢癌[13-14]，尤其近年来HNK抗肿瘤作用成为了广大研究人员的热点[15]。

近年来人们将HNK作为一种天然的先导化合物，对其进行了结构修饰[16-18]。修饰和改造大多集中在酚羟基、烯丙基和酚羟基邻位上，其中主要位点修饰在酚羟基和烯丙基。但通过研究表明[19]，其烯丙基的有无与抗菌作用有关，与抗肿瘤作用无关。徐咏斌[20]将HNK甲酰化，再与盐酸羟胺生成3个和厚朴酚的衍生物，首次采用高速逆流色谱对合成的和厚朴酚生物进行分离纯化。黄齐茂[21]首次将HNK引入光动力领域，将该中药活性小分子与特定卟啉桥连，合成得到和厚朴酚桥连卟啉衍生物。廖世莉[22]将和厚朴酚、槲皮素和小檗碱结合形成烃联结构，并进行体外抗肝癌HepG2细胞活性评价。史晓佳[23]将线粒体靶向载体小檗碱构筑于和厚朴酚分子中，合成10个以小檗碱为线粒体靶向载体的和厚朴酚衍生物，并在HepG2斑马鱼移植瘤模型上进行抗肿瘤活性与细胞选择性。相关研究[24-26]通过引入酯基、酰肼等结构通过烃化反应、还原、电子重排、硼氢化等反应合成了和厚朴酚衍生物。糖基化修饰[27-29]在蛋白质分子和组织细胞间进行识别、粘附和迁移，调控细胞的生长、分裂和分化以及组织生长与修复、癌细胞转移机理；经糖修饰后的药物增加了生物利用度，使得用药间隔延长。

本研究主要以D-半乳糖、L-岩藻糖、D-乳糖、D-麦芽糖为起始原料，对糖上羟基进行保护与去保护，得到一系列的糖片段，利用合成的糖片段对HNK的4′-OH进行结构修饰合成4个和厚朴酚衍生物(图1)，所用原料易得，合成简单，不仅改善和厚朴酚稳定性差及水溶性低的问题，并且也丰富了和厚朴酚糖苷化衍生物的种类，为和厚朴酚类药物及其衍生物的开发利用奠定了基础。

图1 目标化合物的合成路线

1 实验与方法

1.1 仪器与试剂

旋转蒸发仪(EYELA-OSB-2200)、循环水式真空泵(SHZ-D-III)、HJ-3数显恒温磁力搅拌器、三用紫外分析仪(WFH-203B)、INOVA-400与INOVA-500核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；FINNIGANLACQ-DECA质谱仪。

D-半乳糖、L-岩藻糖、D-乳糖、D-麦芽糖、吡啶、三氯乙腈，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。和厚朴酚对照品，西安开来生物工程有限公司。2，3，4，6-四-O-乙酰基-D-吡喃半乳糖亚胺脂(a)、乙基-S-2，3，4-三-乙酰基-L-吡喃岩藻糖苷(b)、2′，3′，4′，6′-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基-(1→4)-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖亚胺脂(c)、2′，3′，4′，6′-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖亚胺脂(d)，实验室自制。

1.2 和厚朴酚糖苷化衍生物的合成

1.2.1 化合物1(和厚朴酚-4′-O-β-D-吡喃半乳糖苷)的合成

精密称量100 mg(0.37 mmol)HNK和50 mg化合物a置于50 mL干燥反应瓶中，加入适量DCM溶解，用N2保护，将反应瓶置于0 ℃平衡10 min后，加入3 μL TMSOTf，TLC监测至反应完全(显色剂为5% H2SO4-C2H5OH，展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1，Rf=0.34)，加入适量TEA调节反应体系pH至中性，用DCM萃取，收集有机相层，用MgSO4除水，过滤，浓缩，得粗产物，用200-300目硅胶填充硅胶柱纯化粗产物(洗脱剂为：Cy∶EtOAc=5∶1/8∶1)，得淡黄色固体和厚朴酚-4′-O-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖苷(化合物A)56 mg，产率为60.5%。

精密称量50 mg(化合物A)，以及10 mL新制甲醇钠(NaOMe)(称取Na粒100 mg置于10 mL MeOH调至pH=11～12)置于反应瓶中，加适量MeOH溶解底物，常温搅拌反应，用TLC监测至反应完全(展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1)，加入阴离子交换树脂，调节反应体系pH至中性，萃取，除水，过滤，浓缩，用凝胶柱纯化粗产物(洗脱剂为甲醇)，得白色固体粉末(化合物1)49 mg，收率为97.6%。

1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ7.56(d，J =3.2 Hz，1H，Ar-6’)，7.46(s，1H，Ar-6)，7.15(dd，J =8.4，2.3 Hz，1H，Ar-4)，7.07(d，J =2.2 Hz，1H，Ar-3)，6.92(d，J =8.4 Hz，1H，Ar-5’)，6.06～5.94(m，2H，8，8’-H)，5.47(s，1H，Ar-3’)，5.31(d，J =13.6 Hz，1H，Glu-1-H)，4.46(d，J =5.2 Hz，2H，9’-H)，4.32(d，J =6.7 Hz，1H，9-H)，4.24(dd，J =11.2，6.0 Hz，4H，7，7’-H)，3.45～3.38(m，5H，Glu-2，3，5，6-H)。13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ159.9(Ar-C4’)，155.5(Ar-C2)，137.8(Ar-C2’)，131.7(C8’，C8)，131.5(Ar-C4)，130.9(Ar-C5)，130.7(Ar-C1’)，130.5(Ar-C1’)，129.9(Ar-C1)，128.4(Ar-C4)，128.1(Ar-C6)，127.8(C9，C9’)，121.1(Ar-C3)，120.7(Ar-C3’)，115.4(Glu-C1)，111.1(C9’，C9)，77.2～53.4(Glu-C2，C3，C4，C5，C6)，31.9(C7’，C7)。

1.2.2 化合物2(和厚朴酚-4′-O-α-L-吡喃岩藻糖苷)的合成

精密称量100 mg HNK、50 mg化合物b、120 mg NBS、50 mg分子筛放置反应瓶中，适量DCM溶解，用N2保护，将反应瓶置于0 ℃平衡10 min后，取3 μL TMSOTf 加入，TLC监测至反应完全(展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1，Rf=0.32)。加适量TEA，调节反应体系pH至中性，DCM萃取，收集有机相，干燥，过滤，浓缩，得粗产物。用硅胶柱后纯化粗产物(洗脱剂为：Cy∶EtOAc=5∶1/8∶1)，得淡黄色固体和厚朴酚-4′-O-2，3，4-四-O-乙酰基-α-L-吡喃岩藻糖苷(化合物B)67 mg，产率为68.6%。

精密称量50 mg化合物B，以及10 mL新制甲醇钠(NaOMe)置于反应瓶中，以甲醇(MeOH)为溶剂，常温搅拌反应。TLC监测至反应完全(展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1)。加入阴离子交换树脂，调节反应体系pH至中性，萃取，除水，过滤，浓缩，得到粗产物。用凝胶柱纯化粗产物(洗脱剂为甲醇)，得白色固体粉末(化合物2)512 mg，收率为99.8%。

1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ7.28(s，1H)，6.27(d，J =3.9 Hz，2H，8，8’-H)，5.48(d，J =3.6 Hz，1H，Glu-1-H)，5.42(dd，J =10.9，3.4 Hz，2H，Ar-4，6’-OH)，5.33(d，J =0.9 Hz，4H，9，9’-H)，5.26(d，J =1.6 Hz，2H，Glu-2，3-H)，5.16(dd，J =10.8，3.6 Hz，2H，Ar-3，5’-H)，4.43(d，J =7.0 Hz，2H，Glu-4，5-H)，3.87(dd，J =6.4，1.0 Hz，4H，7，7’-H)，1.24(d，J =6.4 Hz，3H，CH3)。13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ155.4(Ar-C2)，152.6(Ar-C6’)，137.8(Ar-C2’)，137.9(Ar-C8’)，136.5(Ar-C8)，132.5(Ar-C3’)，131.7(Ar-C5)，130.1(Ar-C2’)，129.6(Ar-C4’)，129.0(Ar-C4)，128.0(Ar-C1’)，127.4(Ar-C3)，126.5(Ar-C6)，117.8(Ar-C1)，116.1(Ar-C9)，115.6(Ar-C9’)，114.5(Ar-C5’)，102.0(Glu-C1)，73.3～71.7(Glu-C4，C3，C2，C5)，39.4(Ar-C7’)，34.0(Ar-C7)。

1.2.3 化合物3(和厚朴酚-4′-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷)的合成

精密称量100 mg HNK、30 mg分子筛和50 mg化合物c放置反应瓶中，加适量DCM溶解，用N2保护，将反应瓶置于0 ℃平衡10 min后，量取3 μL TMSOTf加入，TLC监测至反应完全(展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1，Rf=0.35)。加适量TEA，调节反应体系的pH至中性，DCM萃取，收集有机相，干燥，过滤，浓缩，得粗产物。用硅胶柱纯化粗产物(洗脱剂为：Cy∶EtOAc=5∶1/8∶1)，得淡黄色固体和厚朴酚-4′-O-(2′，3′，4′，6′-四-O-乙酰基-β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖苷(化合物C)60 mg，产率为63.6%。

精密称量50 mg化合物C，以及10 mL新制甲醇钠(NaOMe)置于反应瓶中，以甲醇(MeOH)为溶剂，常温搅拌反应。TLC监测至反应完全(展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1)。加入阴离子交换树脂，调节反应pH至中性，萃取，除水，过滤，浓缩，得到粗产物。用凝胶柱纯化粗产物(洗脱剂为甲醇)，得白色固体粉末(化合物3)51 mg，收率为96.8%。。

1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ7.79(dd，J =8.4，3.0 Hz，1H，Ar-6’)，7.75～7.70(m，1H，Ar-4)，7.60～7.49(m，1H，Ar-3)，7.42(t，J =18.1 Hz，1H，Ar-5’)，7.29(s，1H，Ar-6)，7.11(dd，J =11.9，8.0 Hz，4H，8，8’-H)，5.62(d，J =10.3 Hz，1H，Glu-1-H)，4.43～4.36(m，1H，Glu-1’-H)，4.33(t，J =6.6 Hz，4H，9，9’-H)，4.28～4.15(m，4H，7，7’-H)，4.02～3.94(m，5H，Glu-2，3，5，6-H)，3.94～3.84(m，5H，Glu-2’，3’，5’，6’-H)。13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ153.5(Ar-C2)，141.8(Ar-C1’)，138.2(Ar-C5)，137.9(Ar-C8’)，136.4(Ar-C3’)，136.1(Ar-C8)，136.0(Ar-C6’)，133.1(Ar-C3)，130.3(Ar-C5’)，128.7(Ar-C4)，128.0(Ar-C4’)，127.6(Ar-C6)，127.4(Ar-C2’)，126.6(Ar-C1)，116.1(Ar-C9)，115.6(Ar-C9’)，104.2(Glu-C1’)，102.5(Glu-C1)，78.9～60.5(Glu-C4，C5’，C3’，C5，C3，C2’，C2，C4’，C6’，C6)，39.6(Ar-C7’)，37.1(Ar-C7)。

1.2.4 化合物4(和厚朴酚-4′-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷)的合成

精密称量100 mg和厚朴酚和50 mg化合物d放置反应瓶中，加适量DCM溶解，用N2保护，将反应瓶置于0 ℃平衡10 min后，量取3 μL TMSOTf加入，0 ℃搅拌反应，TLC监测至反应完全(展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1，Rf=0.33)。加适量TEA，调节反应体系的pH至中性，终止反应。DCM萃取，收集有机相，干燥，过滤，减压浓缩得粗产物。用硅胶柱纯化粗产物(洗脱剂为：Cy∶EtOAc=5∶1/8∶1)，得淡黄色固体(化合物D)62 mg，产率为67.1%。

精密称量50 mg化合物D，以及10 mL新制甲醇钠(NaOMe)置于反应瓶中，取适量MeOH溶解底物，常温搅拌反应。TLC监测至反应完全(展开剂为：Cy∶EtOAc=2∶1)。加入阴离子交换树脂，调节反应pH至中性，萃取，除水，过滤，浓缩，得到粗产物。用凝胶柱纯化粗产物(洗脱剂为甲醇)，得白色固体粉末(化合物4)48 mg，收率为90.5%。

1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ7.79(dd，J =8.0，2.6 Hz，1H，Ar-6’)，7.56～7.54(m，1H，Ar-4)，7.46(s，2H，Ar-3’，6)，7.40(d，J =8.1 Hz，1H，Ar-3)，7.27(d，J =13.7 Hz，1H，Ar-5’)，7.14～7.07(m，2H，8，8’-H)，5.62(d，J =10.4 Hz，1H，Glu-1-H)，4.39(t，J =4.5 Hz，1H，Glu-1’-H)，4.37(d，J =1.5 Hz，4H，9，9’-H)，4.25(dd，J =8.2，2.9 Hz，4H，7，7’-H)，4.01～3.99(m，5H，Glu-2，3，5，6-H)，3.69～3.67(m，5H，Glu-2’，3’，5’，6’-H)。13C NMR(151 MHz，CDCl3)δ155.4(Ar-C2)，152.6(Ar-C6’)，137.9(Ar-C8’)，136.5(Ar-C8)，132.5(Ar-C3’)，131.7(Ar-C5)，130.1(Ar-C2’)，129.6(Ar-C4’)，129.0(Ar-C4)，128.0(Ar-C1’)，127.4(Ar-C3)，126.5(Ar-C6)，117.8(Ar-C1)，116.1(Ar-C9)，115.6(Ar-C9’)，114.5(Ar-C5’)，104.2(Glu-C1’)，102.5(Glu-C1)，78.9～60.5(Glu-C4，C5’，C3’，C5，C3，C2’，C2，C4’，C6’，C6)，39.4(Ar-C7’)，34.0(Ar-C7)。

1.3 和厚朴酚衍生物防治结肠癌作用机制的网络药理学预测

运用Swiss TargetPrediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)数据库预测和厚朴酚衍生物的作用靶点；利用GEO DataSets(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和GeneCards(https：//www.genecards.org/)数据库建立结肠癌靶点；以String数据库构建蛋白相互作用网络(PPI network，protein protein interaction network)；利用R语言中的BiocManager“org.Hs.eg.db”进行基因本体(GO)生物学过程和基于京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析并利用BiocManager“enrichplot”和BiocManager“ggplot2”对筛选出具有差异显著的前20个生物过程和信号通路进行可视化；使用PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)和AutoDock进行分子对接。

1.4 水溶性预测

采用Swiss ADME数据库进行HNK及其糖苷化衍生物的水溶性预测。

2 结果与讨论

2.1 化学合成

以和厚朴酚苷元为起始原料，对其4′-OH进行结构修饰，合成得到4个和厚朴酚糖苷衍生物，其中2～4未见文献报道。其反应过程均采用TLC检测，柱层析纯化以及目标化合物通过1H-NMR、13C-NMR进行结构鉴定。

和厚朴酚的4′-OH和2-OH的活性具有显著性差异，活性特点为4′-OH>2-OH[30]。本研究设想先通过不同大小基团对和厚朴酚苷元的4′-OH进行保护，筛选出合适的保护方法，然后再对2-OH进行糖基化修饰。因此以和厚朴酚为原料，分别与乙酸酐溶液、碘甲烷溶液、溴化苄溶液、苯甲醛溶液、二苯甲酰溶液在一定反应条件下进行有机反应，目的是保护和厚朴酚4′-OH，但却未达到理想结果。本文分析原因可能有三，①可能是由于经过乙酰基修饰后的糖链，分子质量相对其他基团较大，且乙酰基在反应溶液中链较长，形成了一定空间位阻，使糖很难与2-OH结合。②和厚朴酚的4′-OH，2-OH活性具有显著性差异，活性特点为4′-OH>2-OH，所以糖链易与4′-OH结合。③考察并排除了反应时间与温度的影响，可能是由于所选取的修饰基团较小，易于酚羟基结合。

2.2 网络药理学预测

2.2.1 和厚朴酚衍生物防治结肠癌的作用靶点

利用Swiss TargetPrediction数据库，预测得到化合物1～4和厚朴酚衍生物防治结肠癌的作用靶点321个。

2.2.2 结肠癌作用靶点

GEO DataSets数据库得到的基因芯片数据，总318个样本。将基因芯片矩阵数据进行标准化处理，用R语言中limma包进行差异基因筛选，共得到3070个差异基因，其中上调基因有1499个，下调基因有1571个，

2.2.3 和厚朴酚衍生物防治结肠癌核心靶点

将17个主要调控靶点导入String数据库中进行和厚朴酚衍生物防治结肠癌主要调控靶点蛋白互作网络分析，筛选得到的这些靶点为和厚朴酚衍生物治疗结肠癌的核心靶基因，结果见图2。

图2 和厚朴酚衍生物防治结肠癌主要调控靶点蛋白互作网络图

2.2.4 GO生物学富集分析

将富集得到的生物过程、细胞组成、分子功能，列举了显著性排名前20的生物过程进行可视化分析，GO富集分析在生物过程中的主要靶点为nuclear division(核分裂)，其他靶点包括蛋白酶体蛋白分解代谢过程、细胞器组织的负调控、DNA代谢过程的调控、染色体分离的调控、细胞周期相变的调控、组蛋白磷酸化、减数分裂细胞周期、有丝分裂纺锤体检查点、蛋白酶体介导的泛素依赖性蛋白分解过程等，结果见图3。

图3 GO富集分析气泡图(A：Biological Process，B：Cellular Component，C：Molecular Function)

2.2.5 KEGG通路富集分析

共富集得到13条信号通路，KEGG通路富集分析表明和厚朴酚糖苷衍生物防治结肠癌主要的信号通路为Cell cycle和Oocyte meiosis，结果见图4。

图4 KEGG通路富集分析气泡图

2.2.6 和厚朴酚衍生物治疗结肠癌核心靶点的通路分析

将36个核心靶点输入KEGG数据库的KEGG Mapper功能中，标注出核心靶点在每条相关信号通路中所占的个数。结果显示有13个靶点蛋白参与Oocyte meiosis信号通路的相关调控，相关基因分别为CCNB2、MAD2L1、CDK1、CDC27、CDC20、FBXO5、PTTG1、ESPL1、BUB1、CDK2、CCNB1、PLK1、AURKA，结果见图5。

图5 和厚朴酚衍生物防治结肠癌核心靶点在卵母细胞减数分裂(Oocyte meiosis)信号通路上的注释图(深色标注的基因代表核心靶基因，灰色标注的基因代表通路原有靶点)

2.2.7 和厚朴酚衍生物与核心靶基因的对接

使用Docking模块进行分子对接，化合物1、2与AURKB基因中4AF3蛋白结合最稳定，化合物3、4与AURKA基因中5DNR蛋白结合最稳定，结果见表1。

表1 核心靶点与和厚朴酚衍生物分子对接结果

2.3 水溶性预测

预测结果见表2，4个化合物的ESOL、Ali和SILICOS-IT预测值均高于HNK预测值，SILICOS-IT的溶解度等级均高于HNK一个等级，且二糖水溶性高于单糖。

表2 水溶性预测结果

预测得到化合物1～4的作用靶点321个和3070个结肠癌差异基因。结果发现，这些核心靶基因参与了多个生物过程和多条信号通路的调节。这些生物过程既彼此调节配合、相互制约，共同达到防治疾病的目的。另外通过查阅文献发现[31-32]，这些通路上的关键靶分子主要是通过诱导癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖，抑制癌细胞侵袭，实现防治结肠癌的作用。分子对接结果表明和厚朴酚糖苷衍生物与核心靶基因之间的结合相对较稳定，提示这些基因可能成为和厚朴酚衍生物防治结肠癌的潜在靶点。水溶性预测中ESOL、Ali和SILICOS-IT为预测指标，Solubility Class为溶解度等级，和厚朴酚衍生物预测值和等级均有提高。

3 结论

本文合成了4种和厚朴酚糖苷衍生物，并运用网络药理学的方法构建了多种和厚朴酚糖苷化衍生物防治结肠癌的作用机制及其水溶性的预测。本文获得的和厚朴酚衍生物不仅丰富了天然化合物的糖苷种类，增加苷元的糖苷数据库，还丰富了和厚朴酚类合成产物的种类，另为进一步研究苷元与其糖苷直接的关联提供了依据以及其后续抗肿瘤的细胞活性筛选、动物实验以及分子机制的研究打下基础。