在线SPE-HPLC-紫外串联荧光检测器同时测定抹茶中的叶黄素、β-胡萝卜素和维生素E*

吴新文，吴华秀，于以竹，黄永桥，张世芹，田乙卜，曹俊杰，杨昌彪

(1贵州省检测技术研究应用中心，贵州 贵阳 550002；2贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550002)

0 引言

抹茶源自中国。宋时，饮茶方法由唐代的煮茶演变为点茶，形成宋代独特精致且复杂的点茶艺术。元代至明代，散茶取代了饼茶与团茶，人们饮用时将散茶放入壶或盏内，直接冲泡，至此抹茶的饮用方式渐渐地退出历史舞台[1]。近年来，抹茶行业的发展呈现快速上升的趋势，我国从事抹茶加工的茶企数量逐年增多，生产规模和市场需求不断在扩大[2]。抹茶是一种纯天然超细微粉体绿茶，它最大限度地保持了绿茶的天然绿色以及营养、药理成分，有很强的表面吸附力及亲和力、固香性及良好的悬浮稳定性等特性，并易被吸收[3]。抹茶的食用方式人体将会获得很多茶叶中的脂溶性活性成分，而普通的泡茶引用茶汤的方式是没办法获得的。茶叶中含有丰富的叶黄素、β-胡萝卜素[4-5]，经测定抹茶中也同样含有丰富的β-胡萝卜素、叶黄素和维生素E。叶黄素是一种天然存在的类萝卜素，它是视网膜中黄斑色素的重要组成部分，可以过滤蓝光，防止视网膜损伤，同时叶黄素还是灵长类动物脑部最重要的类胡萝卜素，不仅可以通过血脑屏障，还可能对维持大脑功能有特殊作用，对维持年长者的认知能力、语言能力有利[6]。β-胡萝卜素是良好的维生素A源，在抗氧化、抗炎、增强免疫、抗肿瘤等方面发挥重要作用[7]。维生素E是人体维持多种生理活动不可替代，又不能自身合成，必须从外界摄取的营养元素，是一种天然的抗氧化剂[7]。抹茶中叶黄素、β-胡萝卜素、维生素E的含量可作为评价抹茶品质的重要指标。

目前对叶黄素、β-胡萝卜素和维生素E的检测通常都使用常规的高效液相色谱法[4-9]，这类方法基本选择紫外检测器进行检测，叶黄素很容易干扰维生素E的定量，同时前处理非常繁琐，加上这三类物质较为不稳定，导致检测结果的准确性很难保证。目前有采用在线净化和中心切割技术结合液相色谱检测维生素、葛根素和芍药苷等检测项目的[10-16]，也有采用液相色谱紫外检测器串联荧光检测器检测抗生素、多环芳烃等检测项目的[17-18]，但是采用在线SPE净化结合液相色谱-紫外检测器串联荧光检测器同时测定抹茶中叶黄素、β-胡萝卜素和维生素E的文献还非常少。本研究采用两泵一阀搭建在线SPE-HPLC-紫外串联荧光检测器分离系统，建立快速分析方法。该方法样品经皂化后可直接进行仪器分析，可同时检测抹茶中的叶黄素、β-胡萝卜素和维生素E。该分析方法简单、快速、高效、定量准确、成本低，完全迎合了目前检测方法的发展需求。

1 实验部分

1.1 材料和仪器

1.1.1 材料

α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚、叶黄素(纯度≥90.0%，TRC)，β-胡萝卜素(纯度≥96.9%，ANPEL)，无水乙醇(分析纯，重庆川东化工有限公司)，甲醇、乙腈(分析纯，科密欧)，磷酸、氢氧化钾(优级纯，科密欧)，BHT、抗坏血酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)，ONLINE PLRP-S固相萃取柱(15～20 μm，4.6 mm×12.5 mm)、poroshell 120 PFP色谱柱(4.6 mm×100 mm，4 μm)(美国Agilent公司)，抹茶(贵州某抹茶生产公司)。

1.1.2 仪器

Agilent1260液相(配有1个四元泵、1个二元泵、1个两位六通阀、1个三通接头、1紫外检测器、1个荧光检测器、自动进样器、柱温箱)(美国Agilent公司)，HH-6J数显恒温磁力搅拌水浴锅(常州市金坛友联仪器研究所)，TG16W高速离心机(长沙平凡仪器仪表有限公司)，ME204天平(美国梅特勒-托利多公司)，vortex-genie2涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别取叶黄素、β-胡萝卜素、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、σ-生育酚10 mg于不同的容量瓶中，用无水乙醇定容至100 mL，配置成浓度为100 μg/mL的标准储备液。

1.2.2 样品的前处理

取2 g抹茶样品于棕色皂化瓶中，加入0.1 g BHT和1 g抗坏血酸，加入20 mL水溶解，加入30 mL乙醇，再加入25 mL 50%氢氧化钾溶液，加入搅拌子，置于恒温磁力搅拌水浴锅中，80 ℃回流皂化40 min，取出冷却，加无水乙醇定容至100 mL，混匀，12000 r/min离心5 min，取上清液过膜上机测定。

1.2.3 仪器条件

仪器搭建如图1所示，皂化液净化柱(SPE柱)：ONLINE PLRP-S(15～20 μm，4.6 mm×12.5 mm)，分析色谱柱：poroshell 120 PFP色谱柱(4.6 mm×100 mm，4 μm)，进样量：100 μL，柱温：35 ℃，紫外检测器：检测波长445 nm，荧光检测器：激发波长294 nm、发射波长328 nm，SPE泵参数条件见表1，分析泵参数条件见表2，阀切换时间见表3。

图1 在线SPE-HPLC-紫外串联荧光检测器系统流路示意图

表1 SPE泵参数条件

表2 分析泵参数条件

表3 阀切换时间

1.2.4 数据采集与数据处理

从1.2.1配制的标准储备液中移取不同的体积按照1.2.2进行处理，得到标准系列溶液，将标准系列溶液和样品处理液按照1.2.3的色谱进行数据采集，建立标准曲线，外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 皂化时间的选择

按照1.2.2方法，抹茶样品选择在80 ℃水浴中回流皂化20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，结果如图2所示。皂化时间从20 min增加到40 min时，各检测组分含量都有不同程度的增加，皂化40 min时样品可能已经皂化完全，各组分测定含量达到最大值，继续延长皂化时间，4种生育酚含量基本上保持不变，而叶黄素和β-胡萝卜素测定含量明显下降，这可能是因为皂化时间太长目标物被氧化的原因。所以皂化时间选择40 min时效果最佳。

图2 皂化时间的选择

2.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器对叶黄素、β-胡萝卜素和4种生育酚进行光谱扫描，如图3所示，叶黄素和β-胡萝卜素在445 nm处有较大吸收，在294 nm处也有吸收；4种生育酚在294 nm处有较大吸收，在445 nm处基本上没有吸收。选择294 nm作为检测波长，色谱图如图4所示，4种生育酚、叶黄素、β-胡萝卜素都有响应，叶黄素和γ-生育酚的保留时间非常接近，很难分离，叶黄素会影响γ-生育酚的定量。选择445 nm为检测波长时，如图5所示，4种生育酚基本上没有响应，叶黄素和β-胡萝卜素的分离度可满足实验定性、定量要求。选择荧光检测器294 nm作为激发波长，328 nm作为发射波长进行检测时，色谱图如图6所示，叶黄素、β-胡萝卜素基本没有响应，4种生育酚分离度可满足实验定性、定量要求。综合考虑，最后选择紫外检测器串联荧光检测器的方法同时进行检测，选择波长445 nm作为叶黄素和β-胡萝卜素的检测条件，选择激发波长294 nm、发射波长328 nm作为4种生育酚的检测条件。

图3 维生素E(4种生育酚)、叶黄素、β-胡萝卜素光谱图

图4 检测波长为294nm时的色谱图

图5 检测波长为445nm时的色谱图

图6 检测器为荧光检测器时的色谱图

2.3 在线SPE净化阀切换时间验证

分析过程中，皂化液进样后经在线 SPE 柱净化，目标物被吸附，样品基质和强碱溶液经两位六通阀切换到废液管路排出色谱系统外，不对液相色谱分离系统造成任何破坏，阀的位置如图7所示，此时液相色谱分离系统处于上样阶段，液相色谱分离系统处于平衡状态。SPE 柱经六通阀切换，阀切换到图8所示的位置，转入液相色谱分离系统，此时 SPE 柱与液相色谱柱串联作为分离系统。当阀再次切换到图8所示位置时为SPE净化柱的再生过程。阀从图7位置切换到图8位置的时间设置太早将会导致净化效果不理想，残留的碱液和杂质会影响后面的分离系统；设置时间太晚，目标物将有可能流失，影响结果的准确性。阀从图8位置切换到图7位置的时间设置太早时，目标物质有可能没有完全洗脱进入后面的分离系统；切阀时间设置太晚时，部分杂质会洗脱进入后面分离系统，干扰目标物质，同时过多的洗脱溶剂会改变流动相的极性，影响目标物的保留时间、峰型和分离度。通过对在线SPE柱废液和洗脱液中目标物质的检测和pH值的测定以及获得的色谱图进行综合考虑，确定阀从图7位置切换到图8位置的时间为4.5 min，从图8位置切换到图7位置的时间为5.9 min，样品图谱如图9所示，获得的峰型良好，分离度良好，基本无杂质干扰。

图7 样品在线净化与SPE柱再生位置

图8 目标物质洗脱的位置

图9 抹茶样品的色谱图

2.4 方法学验证

2.4.1 线性、定量限、精密度、准确度的验证

以化合物峰面积为纵坐标、浓度为横坐标建立各化合物的标准曲线，结果如表4所示，叶黄素、β-胡萝卜素、维生素E的线性均大于0.99，在标准曲线浓度范围内线性关系良好。

以S/N=10计算叶黄素、β-胡萝卜素、维生素E的仪器定量限；按试验1.2的条件验证各化合物方法定量，如表4，叶黄素定量限为0.004 mg/kg，β-胡萝卜素定量限为0.005 mg/kg，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚定量限为0.020 mg/kg，σ-生育酚定量限为0.015 mg/kg。确定的方法定量限均不高于抹茶中各组分的含量，该方法满足抹茶中的叶黄素、β-胡萝卜素、维生素E测定的定量要求。

表4 方法的线性范围、回归方程及定量限

选抹茶2号样品进行6次重复性试验，并对该样品进行3水平加标试验，每个加标水平重复进行6次重复试验，结果如表5所示，6种化合物的 3 水平加标的回收率均在87.0%～112%之间，回收率良好。6 种化合物3水平6次重复性试验的相对标准偏差在1.5%～5.6%之间，精密度良好。

表5 方法的回收率和精密度

2.4.2 实际样品的测定

选择6种抹茶进行含量测定，结果如表6所示，抹茶样品6种化合物的含量均高于方法定量限，不同抹茶样品6种化合物的含量均存在一定的差异性。

表6 抹茶样品测定结果

3 结论

本试验以两泵一阀双检测器搭建了在线SPE-HPLC-紫外串联荧光检测器同时测定抹茶中的叶黄素、β-胡萝卜素和维生素E的检测方法，本方法经皂化后可直接上机测定叶黄素、β-胡萝卜素和维生素E，免去了三个检测项目不同检测方法的复杂前处理操作，选择在线SPE富集、净化目标组分，避免耗费大量溶剂，大大缩短了前处理的时间，同时也避免了繁琐步骤对目标物定量造成的影响，操作简单，自动化程度高，可批量检测样品，完全迎合了目前检测方法的发展需求。且经方法学验证，目标化合物在0.020～20.0 μg/mL浓度范围内，相关系数大于0.99，线性良好，对6个抹茶产品进行测定，稳定性良好，可作为实验室检测抹茶中叶黄素、β-胡萝卜素和维生素E的检测方法。