基于生物信息学分析PTX3基因在乳腺癌中的表达及临床意义

赵雅雯，马勇杰

（天津医科大学肿瘤医院肿瘤细胞生物学实验室，国家肿瘤临床医学研究中心，天津市恶性肿瘤临床医学研究中心，乳腺癌防治教育部重点实验室，天津市“肿瘤防治”重点实验室，天津 300060）

乳腺癌在全球女性癌症中的发病率为24.2%，位居女性癌症的首位。在我国，乳腺癌发病率每年呈上升趋势，每年有30余万女性被诊断出乳腺癌[1]。早期乳腺癌被认为是可以被治愈的[2]。然而，仍有部分乳腺癌是无法治愈的，特别是晚期乳腺癌[3]。所以，探索乳腺癌相关标志物有利于其进行靶向治疗，并且能够更进一步的了解疾病发生、发展的分子机制。

五聚蛋白3（pentraxin 3，PTX3）是一种多聚糖蛋白，也是体液先天免疫的重要组成部分，全长共包含381个氨基酸。PTX3基因位于3号染色体上，由3个外显子组成：第一个外显子编码信号肽，第二个外显子编码N端结构域，第三个外显子编码C端结构域；PTX3的启动子含有多个转录因子结合位点，包括Pu1、核因子（NF）-κB、SP1、NF-白细胞介素（IL）6和激活蛋白（AP）-1[4-5]。PTX3表达是由几种细胞类型的炎症或微生物刺激诱导的，是对真菌、细菌和病毒来源的选定病原体的先天抵抗力的重要介质并参与炎症、组织重塑和癌症的调节[6]。有文章报道PTX3可介导乳腺癌细胞分化为BOLCs细胞和HA晶体的形成[7]。基于此证据，PTX3被认为是低分化型乳腺癌的新标志物[8]。然而，PTX3在乳腺癌发生、发展中的作用鲜有报道。本研究基于TIMER数据库[9]、GEPIA2.0数据库[10]、Kaplan-Meier Plotter数据库[11]、UALCAN数据库[12]、STRING数据库[13]以及CancerSEA数据库[14]进行数据挖掘，进而分析PTX3基因在乳腺癌中的表达情况及其预后意义，为后续研究PTX3基因在乳腺癌中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 在两个数据库中分析PTX3在乳腺癌中的表达情况TIMER数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）计算了来自32种癌症类型的10 897份样本。该数据库提供了6个主要分析模块，包括TIIC丰度与基因表达（gene），总生存期（survival），体细胞突变（mutation）和DNA体细胞拷贝数改变（SCNA）的关联，以及差异基因表达（Diff Exp）和基因-基因相关性（correlation）[9]。本文通过此数据库来分析不同癌症类型和正常癌组织中PTX3 mRNA的表达情况，在Diff Exp的选项中输入基因名PTX3并分析其在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的PTX3 mRNA的表达情况。

GEPIA2.0数据库（http://gepia2.cancer-pku.cn/#index）是一个交互式网络应用程序，对来自TCGA和GTEx数据库的9 736个肿瘤和8 587个正常样本进行基因表达分析，使用RNA测序数据的标准进行输出[10]。本文从GEPIA2.0数据库中获得PTX3基因与正常组织的差异基因表达分析（DEGs），其中认为差异显著的阈值为|log2FoldChange|>1.0，P<0.01。从而可分析得到PTX3 mRNA在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的的表达情况。

1.2 利用UALCAN数据库分析PTX3的表达与临床特征和预后的关系UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）使用来自31种癌症类型的TCGA RNA-seq数据和临床数据进行检索[12]。在基因名处输入PTX3，在癌症类型中选择乳腺癌。然后分别对年龄、TNM分期、淋巴结转移数以及TP53突变等临床特征进行分组以及预后情况进行分析。

1.3 Kaplan-Meier Plotter绘图仪数据库分析PTX3 mRNA表达水平与乳腺癌患者预后的关系分析Kaplan-Meier Plotter绘图仪数据库（http://kmplot.com/analysis/）能够评估30 000基因（mRNA，miRNA，蛋白质）的表达与来自21种肿瘤类型（包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌和胃癌）的25 000个样本存活率之间的相关性。数据库的来源包括GEO、EGA和TCGA。本文运用此数据库分析了PTX3 mRNA表达水平与乳腺癌患者预后的关系，所用探针ID为206157-at。为了对乳腺癌患者总体生存期和无进展生存期进行分析，自动选择截止时间将患者样本分为高表达和低表达两组。总体生存期定义为从疾病确诊日期到最后一次随访日期或患者死于乳腺癌的日期；无进展生存期定义为从开始用药到乳腺癌患者最早出现局部复发、远处转移或者死亡的时间。运用COX回归分析方法计算两组病例之间的预后风险比（hazard ratio，HR）和95%置信区间，同时计算Log-rank P值，P<0.05为有统计学意义。并运用此方法分析PTX3 mRNA表达水平与各亚型乳腺癌患者总体生存期以及无进展生存期的关系。1.4利用STRING数据库构建PTX3蛋白相互作用网络STRING数据库（https://cn.string-db.org/）用于构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，目前在89个全测序基因组中包含261 033个同源基因[15]。本文通过该数据库对PTX3蛋白相关的蛋白网络进行分析。

1.5 利用CancerSEA数据库分析PTX3在单个细胞里的功能相关性CancerSEA数据库（http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/）描绘了一个癌症单细胞功能状态图谱，其中包含25种癌症类型的41 900个癌症单细胞的14种功能状态[包括干性、侵袭、转移、增殖、上皮-间充质转化（EMT）、血管生成、细胞凋亡、细胞周期、分化、DNA损伤、DNA修复、缺氧、炎症和沉默][14]。本文则利用该数据库分析PTX3基因在乳腺癌中的功能相关性。为后续实验验证奠定了基础。

1.6 统计学处理 采用非参数Mann-Whitney检验分析比较基于TIMER和GEPIA2.0数据库的PTX3 mRNA表达水平的差异；利用非参数Mann-Whitney检验分析比较PTX3在乳腺癌不同临床亚组中的表达差异；利用Kaplan-Meier生存分析法判断PTX3 mRNA表达水平与乳腺癌患者预后及不同亚型的乳腺癌患者预后的关系，采用Log-rank检验计算高低表达水平的生存差异得出P值。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 利用TIMER和GEPIA2.0两大数据库分析PTX3 mRNA在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的差异表达 本研究首先通过TIMER数据库分析比较了PTX3 mRNA在正常乳腺组织（n=112）和乳腺癌组织（n=1 093）中的差异表达，结果显示PTX3在乳腺癌组织中的表达明显低于在正常乳腺组织中的表达（图1A）。另外，本文还通过GEPIA2.0数据库进行分析，分析结果显示与TIMER数据库所得到的结果一致，PTX3 mRNA在乳腺癌组织（n=1 085）中表达低于正常乳腺组织（n=291）（图1B）。

图1 TIMER数据库和GEPIA2.0数据库中PTX3 mRNA在浸润性乳腺癌组织中和在正常乳腺组织中的表达情况Fig 1 Expression of PTX3 mRNA in invasive breast cancer tissue and normal breast tissue in TIMER database and GEPIA2.0 database

2.2 PTX3在乳腺癌不同临床亚组中的表达情况 通过检索UALCAN数据库分析PTX3 mRNA在不同年龄亚组中的表达情况，将乳腺癌样本按年龄分为4个组别与正常组织样本进行比较，分别为：21～40岁（n=97）、41～60岁（n=505）、61～80岁（n=431）、81～100岁（n=54）。结果显示PTX3 mRNA在正常组织中的表达明显高于乳腺癌组织，其中，年龄为61～80岁的乳腺癌患者PTX3 mRNA的表达显著低于41～60岁乳腺癌患者，其余年龄亚组组别无显著差异（图2A）；在肿瘤TNM分期方面，4期乳腺癌患者中的PTX3 mRNA表达低于1期和2期乳腺癌患者，3期乳腺癌患者的PTX3 mRNA的表达低于2期（图2B）；在淋巴结转移数分组方面，N2组和N3组PTX3 mRNA的表达均低于N0组（图2C）；有TP53突变亚组比未突变亚组的PTX3表达量高且具有统计学意义（图2D）。

图2 PTX3在乳腺癌不同临床亚组中的表达情况Fig 2 Expression of PTX3 in different clinical subgroups of breast cancer

2.3 利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析PTX3 mRNA表达水平与乳腺癌患者预后的关系

2.3.1 PTX3 mRNA表达水平与乳腺癌患者总人群预后的关系 为了进一步研究PTX3在乳腺癌中的预后价值，通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析发现，PTX3 mRNA高表达的乳腺癌患者的总体生存期（HR=0.80，95%CI：0.65～0.97，P=0.026）（图3A）和无进展生存期（HR=0.89，95%CI：0.8～0.99，P=0.032）（图3B）更长，且两者与低表达组相比较均具有统计学意义。

图3 PTX3 mRNA表达水平与乳腺癌患者总人群预后的关系Fig 3 The relationship between PTX3 mRNA expression level and prognosis of patients with breast cancer

2.3.2 PTX3 mRNA表达水平与各亚型乳腺癌患者预后总体生存期和无进展生存期的关系 为了进一步研究PTX3对不同亚型的乳腺癌患者的总生存期的影响，通过Kaplan-Meier Plotter数据库进行分析，结果显示在Luminal A型（HR=0.66，95%CI：0.48～0.92，P=0.013）（图4A）以及基底样型乳腺癌患者（HR=0.65，95%CI：0.44～0.94，P=0.023）（图4D）中，PTX3 mRNA高表达的患者总体生存期更长。然而PTX3的表达水平并不影响Luminal B型（HR=0.72，95%CI：0.49～1.06，P=0.091）（图4B）和Her2阳性型乳腺癌患者（HR=0.75，95%CI：0.42～1.32，P=0.31）（图4C）的总体生存期。分析PTX3对不同亚型的乳腺癌患者的无进展生存期影响发现在Luminal A型（HR=0.78，95%CI：0.66～0.92，P=0.002 8）（图5A），Luminal B型（HR=0.79，95%CI：0.66～0.94，P=0.007 6）（图5B）以及基底样型乳腺癌患者（HR=0.69，95%CI：0.55～0.87，P=0.001 2）（图5D）中，PTX3 mRNA高表达的患者无进展生存期更长。然而在Her2阳性型乳腺癌患者（HR=1.29，95%CI：0.9～1.84，P=0.17）（图5C）中则无此差异。

图4 PTX3 mRNA表达水平与各亚型乳腺癌患者总体生存期的关系Fig 4 The relationship between PTX3 mRNA expression level and overall survival of patients with various subtypes of breast cancer

图5 PTX3 mRNA表达水平与各亚型乳腺癌患者无复发生存期（RFS）的关系Fig 5 The relationship between PTX3 mRNA expression level and recurrence free survival（RFS）of patients with various subtypes of breast cancer

2.4 PTX3蛋白相互作用网络通过STRING数据库分析 得到具有11个节点数的PTX3蛋白互作网络，其中与PTX3相互作用的蛋白（score>0.9）包 括FGF2、FCN1、CFH、FCN2、TNFAIP6、SELP、MBL2、C1QA、CFHR1等（图6），其富集条件为3.8e-07。

图6 PTX3在乳腺癌中的蛋白质-蛋白质相互作用网络Fig 6 Protein-protein interaction network of PTX3 in breast cancer

2.5 PTX3在单个细胞里的功能相关性分析CancerSEA数据库的功能相关性分析表明，在单个乳腺癌细胞中PTX3基因表达与乳腺癌功能状态的相关性进行分析，PTX3基因的表达与炎症呈显著正相关（r=0.74，P<0.001），与转移、干细胞特性、组织缺氧呈显著负相关（r=-0.42、-0.4、-0.32，P均<0.001）（图7）。

图7 PTX3基因表达与乳腺癌细胞功能状态的相关性Fig 7 Correlation between PTX3 gene expression and functional status of breast cancer cell

3 讨论

乳腺癌是全世界女性中最常见的癌症之一。在发展中国家，乳腺癌的发病率持续增加，许多病例直到晚期才被诊断出来[16]。尽管辅助化疗和激素药物的使用已经改善了乳腺癌的死亡率，但是也有部分患者未能从中获益。因此寻找早期诊断和治疗乳腺癌的靶点基因对改善患者生存率至关重要。

本研究基于TIMER和GEPIA2.0数据库分析发现，PTX3 mRNA在乳腺癌组织中的表达低于乳腺正常组织。通过UALCAN数据库分析PTX3 mRNA与乳腺癌患者临床特征的关系发现，PTX3 mRNA表达水平与年龄、TNM分期、淋巴结转移数和TP53突变有关。为了进一步了解PTX3如何参与乳腺癌的发生和发展，通过Kaplan-Meier Plotter数据库分析PTX3 mRNA的表达水平与乳腺癌预后关系显示，PTX3 mRNA高表达的乳腺癌患者的总体生存期和无进展生存期更长，提示PTX3可能作为抑癌因子在乳腺癌中发挥作用。有报道称，在3-甲基胆蒽（3-MCA）诱导的以及7，12-二甲基苯并[α]蒽/对苯二甲酸（DMBA/TPA）诱导的皮肤癌小鼠模型中，PTX3缺失导致间充质细胞和上皮细胞致癌的易感性增加。在此模型中，浸润的白细胞，特别是单核-巨噬细胞和内皮细胞是PTX3对局部产生的IL-1的主要来源，两者都有助于PTX3依赖的抗癌作用。PTX3缺失与巨噬细胞肿瘤浸润增强、促炎细胞因子产生、血管生成、补体关键成分（C3和C5a受体）表达水平有关，导致肿瘤相关炎症的加剧，而PTX3对肿瘤细胞增殖无直接影响[17]。因此，PTX3在癌症相关炎症（CRI）中可作为外源性的肿瘤抑制因子基因，通过调节补体级联反应抑制CRI[18]。另有研究表明PTX3可抑制膀胱癌的细胞增殖、运动、代谢和干性[19]。以上数据表明PTX3可能在抑制肿瘤进展中发挥作用。

为了后续更进一步了解PTX3在乳腺癌中的生物学功能及其调控网络，本文又利用STRING蛋白相互作用网络和CancerSEA数据库从两个不同方面分析了PTX3蛋白在乳腺癌中可能发挥的功能，两个数据库同时显示此蛋白在乳腺癌发生、发展中可能是通过炎症信号道路来抑制乳腺癌的进展。众所周知，炎症参与某些疾病的病理生理学，是癌症发展和发病机制的标志性特征[20]。炎症信号通路通常为NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Janus激酶-信号转导与转化激活蛋白（JAK-STAT）通路[21]。有研究发现PTX3可作为NF-κB/p65调控的目标分子，利用I-кB激酶抑制剂IKK-16抑制PTX3表达从而抑制p65，导致肺癌细胞的迁移和侵袭能力减弱[22]。另有研究证明，在胃癌中，细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）-α通过下调PTX3促进胃癌的侵袭、转移和EMT，表明PTX3与细胞因子之间存在潜在联系[23]。以上数据与笔者预测结果一致。另外，PTX3与成纤维细胞生长因子-2（FGF2）/FGF受体（FGFR）系统相互作用，并通过其N端结构域抑制EMT，从而抑制黑色素瘤[24]、乳腺癌[25]、前列腺癌[26]和多发性骨髓瘤[27]的肿瘤转移、肿瘤生长和肿瘤血管生成[23]。综上所述，PTX3可能通过调控炎症信号通路、细胞因子或与FGF2的相互作用，抑制乳腺癌的发生、发展。然而，PTX3具体在乳腺癌中是如何发挥抑癌作用的有待进一步验证。

总之，本研究利用生物信息学分析手段对乳腺癌进行分析发现PTX3在乳腺癌组织中低表达并与TNM分期、淋巴结转移等相关，且高表达患者预后较好。此为临床基因治疗提供了理论基础。在功能方面，PTX3蛋白主要参与炎症且呈正相关，与转移、干细胞特性、组织缺氧呈显著负相关。这为进一步研究PTX3基因在乳腺癌中的作用和分子机制提供了依据和线索。