裸花紫珠总黄酮提取工艺及抗HBV活性成分研究

廖红兰 陈 路 马健雄

1.广西壮族自治区妇幼保健院，广西 南宁 530003； 2.广西壮族自治区药用植物园，广西 南宁 530023；3.南宁生源中药饮片有限责任公司，广西 南宁 530025

裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.et Arn.)为马鞭草科植物，药用部位为干燥地上部分。该药材性平味苦、微辛，具有消炎、止血、解肿毒、化湿浊等功效[1]。临床研究[2-3]显示，裸花紫珠对急慢性乙型肝炎的治疗具有显著疗效，但其作用机制及活性成分尚未明确。研究[4-5]发现，裸花紫珠含有多种化学成分，其中黄酮类化合物是其主要成分之一。黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，具有抗炎抗氧化等多种药理活性。化学成分研究是中药新药研发的基础工作，有效成分的确定对进一步提高中药材的品质，完善其质量标准，实现中药现代化具有深远意义。研究[6-8]发现，天然植物中所含的总黄酮能明显降低乙型肝炎模型大鼠血清HBsAg、HBeAg水平，可改善大鼠肝损伤情形，抑制其纤维化，保护其肝功能，其作用机制与下调TGF-β/Smad3通路有关。因此，为明确裸花紫珠治疗乙型肝炎的有效成分，本文采用正交试验设计优选了裸花紫珠总黄酮的提取工艺，并进行相关药理活性研究，以期为该药材有效成分的筛选及深入开发利用提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 SF130型药材粉碎机(温州顶历医疗器械有限公司)，KD-1018YS型超声波清洗仪(深圳市科达超声自动化设备有限公司)，旋转蒸发仪(上海贤德实验仪器有限公司)，循环水式真空泵(上海万经泵业制造有限公司)，UV752紫外分光光度计(青岛精诚仪器仪表有限公司)，KDM型可调控温电热套(杭州艾普仪器设备有限公司)，FA2204B型电子天平(上海精密仪器仪表有限公司)，KH19A离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)，101-0ABE型电热鼓风干燥箱(上海坤天实验室仪器有限公司)，CO2孵箱(山东博科干细胞应用研究院)。

1.2 材料 裸花紫珠，采自广西南宁市郊，经广西壮族自治区药用植物园蓝鸣生教授鉴定为马鞭草科植物裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook.et Arn.)。芦丁对照品(批号：100080-201811，中国食品药品检定研究院)；HBsAg、HBeAg试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司)；HBV荧光定量试剂盒(达安基因公司)；拉米夫定(葛兰素史克制药有限公司)；试验用水为蒸馏水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 方法学考察

2.1.1 供试品溶液的制备 称取裸花紫珠药材50 g，置于1000 mL圆底烧瓶中，加入70%乙醇适量，浸泡10 min，加热回流提取2次，每次1 h。抽滤除去药渣，合并提取液，减压回收乙醇至约200 mL，离心5 min(10000 r/min)，离心液倾入250 mL容量瓶，70%乙醇定容，摇匀即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取芦丁对照品10.18 mg置于50 mL容量瓶中，用适量70%乙醇溶解并定容至刻度，制得浓度为0.2036 mg/mL对照品溶液。

2.1.3 标准曲线的制定 精密量取“2.1.2”项下对照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，分别置于25 mL量瓶中，各瓶依次加入5%亚硝酸钠溶液、10%硝酸铝溶液各1 mL和氢氧化钠溶液10 mL，摇匀静置。设置空白组，采用可见分光光度法进行定量，在500 nm下测定吸光度。以吸光度为Y轴，浓度为X轴绘制标注曲线，得回归方程：y=10.069x+0.0412(r2=0.9997)，说明线性关系良好。如图1所示。

图1 标准曲线效果图

2.1.4 稳定性试验 精密量取“2.1.1”项下供试品溶液0.5 mL，按“2.1.3”项下方法分别于0 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h测定吸光度。结果吸光度RSD值为3.25%(n=6)，说明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.5 精密度试验 精密量取“2.1.1”项下供试品溶液0.5 mL，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，重复测定6次，RSD值为1.25%(n=6)，说明该检测方法精密度良好。

2.1.6 重现性试验 称取裸花紫珠药材50 g，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，测定吸光度，计算总黄酮含量，重复试验6次。结果总黄酮平均百分含量为10.98%，RSD值为1.75%(n=6)，说明该检测方法重现性良好。

2.1.7 加样回收试验 称取裸花紫珠药材3份，每份25 g，制成含量不同的样品(芦丁含量为40.50 mg/g、41.25 mg/g、42.50 mg/g)，分别依次加入相同量(为已知含量的100%)的芦丁对照品，依法制得供试品溶液，按“2.1.3”项下方法测定吸光度并计算回收率，平行试验3次。结果芦丁的平均回收率为99.26%，RSD值为1.18%(n=9)，表明该检测方法回收率良好。

2.2 正交试验设计

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 乙醇浓度对总黄酮百分含量影响 称取裸花紫珠药材50 g，用10倍量乙醇提取2次，每次1 h，分别考察40%、50%、60%、80%、90%乙醇提取效果。结果总黄酮提取率随乙醇浓度增大而升高，60%乙醇提取率接近峰值，之后有回落趋向。如图2所示。

图2 乙醇浓度对总黄酮百分含量影响图

2.2.1.2 料液比对总黄酮百分含量影响 称取裸花紫珠药材50 g，用70%乙醇提取2次，每次1 h，分别考察料液比为1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶50的提取效果。结果显示料液比1∶20提取率接近峰值，之后增速缓慢。如图3所示。

图3 料液比对总黄酮百分含量影响图

2.2.1.3 提取时间对总黄酮百分含量影响 称取裸花紫珠药材50 g，用10倍量70%乙醇提取2次，考察提取时间0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h的提取效果。结果显示提取2 h效果较好。如图4所示。

图4 提取时间对总黄酮百分含量影响图

2.2.1.4 提取次数对总黄酮百分含量影响 称取裸花紫珠药材50 g，用10倍量70%乙醇提取1 h。考察提取1次、2次、3次、4次、5次的提取效果，结果总黄酮提取率随着提取次数的增多而升高，但提取2次后增速缓慢。如图5所示。

2.2.2 多因素试验 根据单因素试验结果及前期摸索的经验，分别选择A(乙醇浓度)、B(料液比)、C(提取时间)、D(提取次数)4个因素，每个因素设置3个水平进行试验，综合考察各因素水平对总黄酮得率的影响。如表1、表2、表3所示。

图5 提取次数对总黄酮百分含量影响图

表1 正交试验因素水平表

表2 L9(34)正交试验方案及结果表

表3 方差分析表

由表2中极差分析结果可以看出，对总黄酮得率影响的主次因素依次是：A>B>C>D，即乙醇浓度>料液比>提取时间>提取次数；表3中方差分析结果显示，各因素均不具显著性。综合以上分析优选最佳提取工艺为：A2B2C3D2，即60%乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比为1∶20。

2.3 工艺验证 称取3批裸花紫珠药材各50 g，按最佳工艺条件进行提取，每批次平行试验3次，结果总黄酮平均百分含量为11.29%，RSD值<2%，说明该工艺稳定性良好。详见表4。

表4 裸花紫珠最佳提取工艺验证

3 体外抗HBV活性测试

取“2.3”项下第2批次总黄酮提取物适量，用60%乙醇溶解，加入醋酸铅胺沉淀过滤，滤液浓缩后过大孔树脂、聚酰胺和硅胶柱，将分离纯化后的样品与标准品芦丁对照，测得总黄酮含量为72.6%。

3.1 细胞毒性试验 取上述过柱后的总黄酮提取物样品适量，制成不同浓度的含药培养液。取HepG2.2.15细胞，用培养液调整浓度至1×105mL-1，接种于96孔板，200 μL/孔，各孔分别加入上述含药培养液200 μL，每个浓度6孔，设置空白对照组，将各组细胞置于CO2孵箱进行培养72 h。按照Reed-Muench 法计算得：TC0=250 μg/mL，TC50>500 μg/mL。即当样品浓度≤250 μg/mL时，裸花紫珠总黄酮提取物对HepG2.2.15无细胞毒性。

3.2 对HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的抑制作用 取上述过柱后的样品适量，用培养液分别制成25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL含药培养液。另取HepG2.2.15细胞，用培养液调整浓度至1×105mL-1，接种于96孔板，200 μL/孔，各孔分别加入上述含药培养液200 μL，每个浓度6孔，设置空白对照组，置CO2孵箱进行培养。72 h后，收集上清液按照HBsAg、HBeAg及HBV-DNA试剂盒说明书进行操作，在490 nm处测定各组OD值，计算HBsAg、HBeAg及HBV-DNA抑制率。HBsAg、HBeAg抑制率=(空白对照组OD值-剂量组OD值)/空白对照组OD值；HBV-DNA抑制率=(空白对照组DNA拷贝数-剂量组DNA拷贝数)/空白对照组DNA拷贝数。结果显示，总黄酮提取物各剂量组对HBsAg、HBeAg及HBV-DNA均有抑制作用，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

表5 裸花紫珠总黄酮提取物对HBsAg、HBeAg及HBV-DNA的抑制作用

4 讨论

裸花紫珠作为新增品种收录于2020年版《中国药典》(一部)，具有抗炎、止血、抑菌、抗氧化性及抗肿瘤等多种药理作用，临床广泛应用于各类型感染、出血、痤疮、结核等疾病的治疗和预防，具有很高的药用价值和经济价值[9-11]。研究结果表明裸花紫珠总黄酮提取物具有一定的抗HBV活性，市场开发潜力巨大，故优化总黄酮类的提取工艺流程，对其单味药材及成方制剂的工业化生产具有重要意义。研究通过正交试验设计优选了裸花紫珠总黄酮的提取工艺为60%乙醇回流提取2次，每次2 h，料液比为1∶20，工艺稳定性良好。

提取方法的选择，在参考现有文献的基础上，结合实验室研究实际，对比分析了乙醇回流提取法和乙醇超声提取法等方法。在相同实验条件下，乙醇回流提取法总黄酮提取率略高于其他提取法，故选用乙醇回流提取法。

细胞系的选择，HepG2.2.15细胞是HepG2细胞所衍生，是抗HBV新药开发的一个良好的体外研究工具。该细胞株是用2个头尾相连的HBV-DNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外无性繁殖，能够长期稳定地向培养上清中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，而且还能产生大量的复制中间体，是体外筛选抗HBV药物的良好模型。在参考相关文献的基础上选择HepG2.2.15细胞进行实验[12-13]。本试验仅初步证明了裸花紫珠总黄酮提取物的抗HBV作用，这也进一步印证了该药材全株具有治疗急慢性肝炎的临床经验记载，但具体活性单体成分还有待进一步研究。