清解益肺苗方颗粒薄层鉴别方法研究

晏 琴 李 江* 刘 炜 刘顶鼎

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550001

肺癌的发病率逐年增高，据世界肿瘤的首位。在已确诊的肺癌种类中非小细胞肺癌占据了80%～85%的比例[1]。此类肺癌早期可控，5年存活率低于15%。现阶段，肺癌的治疗手段主要有手术切除、靶向治疗、免疫治疗等，但是均存在一定的毒副作用，且治疗费用高[2]。非小细胞肺癌患者若长期服用西药，很容易产生耐药性，严重者会导致肝肾功能损伤，从而影响药物的药效。而中药在治疗肿瘤方面具有独特的优势，可通过抑制肺癌血管生成提高治疗效果，具有缓解耐药性、增效减毒等效应[3]。中药化学成分复杂多样，可多途径抑制肿瘤生长，故对有效治疗肺癌的药物研发尤为重要。

清解益肺苗方是基于贵州中医药大学刘自平教授的临床经验方，清解益肺苗方颗粒是由黄芪、南沙参、鱼腥草、白花蛇舌草、余甘子、法半夏、浙贝母、吉祥草、冬凌草、炒薏苡仁、半枝莲、仙鹤草12味中药组方制成的颗粒剂，具有益气养阴、解毒散结的功效；适用于气阴两虚型非小细胞肺癌患者。方中黄芪归肺脾二经，具有补气养阴、健脾利水之功，寓“培土生金”之义；南沙参性微寒，归肺、胃二经，具有养阴生津、化痰益气之功效，应肺脏“喜润恶燥”的生理特性，两者合用为君药；臣以余甘子清热润肺生津；白花蛇舌草和鱼腥草配伍以清热解毒、化痰散结。该制剂前期已通过动物实验验证可抑制小鼠Lewis肺癌生长、转移及肿瘤新血管生成，具有很好的抗肺癌作用[4]。清解益肺汤在长期的临床应用中取得了较好的疗效，但汤剂存在服用量大，不易携带和运输，口感酸涩，难以下咽，易变质等缺点。故从患者用药、携带、运输和贮藏等角度考虑，将该方制备成颗粒剂。并且该制剂未进行过相关质量方面研究，缺乏有效指标来确保制剂质量可控性；故建立黄芪、南沙参、余甘子、鱼腥草、白花蛇舌草的定性方法作为清解益肺苗方颗粒的质量控制指标。

1 仪器与材料

1.1 仪器 ZF-1型三用紫外线分析仪(上海金鹏分析仪器有限公司)、101-1A型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)、DRHH-S4数显恒温水浴锅(上海双捷实验设备有限公司)、SK5200H超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)、METTLER电子分析天平。

1.2 材料 硅胶板(G板，青岛海洋化工有限公司制造)；甲醇(批号20201127，国药集团化学试剂有限公司),乙醇(批号：20200921，国药集团化学试剂有限公司),丙酮(批号：20180821，天津市科密欧化学试剂有限公司),乙酸乙酯(批号：2010131，四川西陇科学有限公司),氨水(批号：20200704，重庆江川化工(集团)有限公司)；试验用水为纯化水；黄芪(批号：120974-201813)、南沙参(批号：121499-201605)、余甘子(批号：121289-201804)、鱼腥草(批号：121046-201607)、白花蛇舌草(批号：121183-201605)等对照品及对照药材均购自中国食品药品检定研究院。

2 方法与结果

2.1 清解益肺苗方颗粒的制备 清解益肺苗方颗粒的制备工艺为：按处方量称取12味药材，加12倍量水，煎煮1 h，滤过，合并滤液，浓缩，加适量可溶性淀粉制成颗粒，即得。为有效验证实验，按清解益肺苗方颗粒制备方法制备3个不同批次的样品备用(编号为20210728、20210729、20210730)。

2.2 黄芪的薄层鉴别[5]分别取3批本品颗粒适量，研成细粉，称取5 g置具塞锥形瓶中，加乙醇30 mL，加热回流20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加0.3%氢氧化钠溶液15 mL使溶解，滤过，滤液用稀盐酸调节pH值至5～6，用乙酸乙酯15 mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取黄芪对照药材2 g，同供试品溶液方法制成对照药材溶液。按清解益肺苗方配比制备缺黄芪的阴性制剂，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2020版四部附录(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液及阴性样品溶液各10 μL，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上；以三氯甲烷-甲醇(10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果显示3批供试品色谱中所呈现的荧光主斑点，在与对照药材色谱荧光斑点相应的位置上，显相同的颜色，且阴性对照无干扰。结果如图1所示。

1～3.供试品(20210728、20210729、20210730)；4.阴性对照溶液；5.黄芪对照药材

2.3 南沙参的薄层鉴别 分别取3批本品颗粒适量，研成细粉，称取5 g置具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，于80 ℃下加热回流1 h，用铺有适量无水硫酸钠的滤纸滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即为供试品溶液。取南沙参对照药材2 g，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按清解益肺苗方配比制备缺南沙参的阴性制剂，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2020版四部附录(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上；以三氯甲烷-甲醇-甲酸(9∶1∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸试液，在105 ℃加热至斑点显色清晰[6]。结果显示3批供试品色谱中所呈现的斑点，在与对照药材色谱斑点相应的位置上，显相同的颜色，且阴性对照无干扰.结果如图2所示。

1～3.供试品(20210728、20210729、20210730)；4.阴性对照溶液；5.南沙参对照药材

2.4 余甘子的薄层鉴别 分别取3批清解益肺苗方颗粒适量，研成细粉，称取5 g置具塞锥形瓶中，加乙醇20 mL，超声处理30 min(功率250 W，频率33 kHz)，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇1 mL使溶解，即为供试品溶液。取余甘子对照药材1 g，同供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按清解益肺苗方配比制备缺余甘子的阴性制剂，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2020版四部附录(通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液及阴性样品溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上；以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5.5∶4.5∶0.25)为展开剂，展开约8 cm，取出，晾干，置紫外灯(254 nm)下检视[7]。结果显示3批供试品色谱中所呈现的斑点，在与对照药材色谱斑点相应的位置上，显相同的颜色，且阴性对照无干扰。结果如图3所示。

1～3.供试品(20210728、20210729、20210730)；4.阴性对照溶液；5.余甘子对照药材

2.5 鱼腥草的薄层鉴别 分别取3批本品颗粒适量，研成细粉，称取5 g置具塞锥形瓶中，加水20 mL，搅拌均匀，加入乙醚20 mL，超声提取2次(功率250 W，频率33 kHz)，每次15 min，转移至分液漏斗中，分取乙醚层，将乙醚蒸干，残渣加乙醚2 mL使溶解，即为供试品溶液。另取鱼腥草对照药材 1 g，加乙醚15 mL，静置30 min，超声提取 2 次，每次15 min，滤过，将乙醚液蒸干，残渣加乙醚2 mL使溶解，即为对照药材溶液。按清解益肺苗方配比制备缺鱼腥草的阴性制剂，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2020版四部附录(通则0502)试验，吸取上述供试品溶液、对照药材溶液及阴性样品溶液各5 μL，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上；以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶3∶0.5) 为展开剂，展开， 取出，晾干，喷以 10% 硫酸乙醇溶液，置紫外灯下(365 nm) 下检视[8]。结果显示3批供试品色谱中所呈现的荧光主斑点，在与对照药材色谱荧光斑点相应的位置上，显相同的颜色，且阴性对照无干扰。结果如图4所示。

1～3.供试品(20210728、20210729、20210730)；4.阴性对照溶液；5.鱼腥草对照药材

2.6 白花蛇舌草的薄层鉴别 分别取3批清解益肺苗方颗粒适量，研成细粉，称取5 g置具塞锥形瓶中，加水10 mL，搅拌均匀，用乙酸乙酯萃取2次，每次10 mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即为供试品溶液。取白花蛇舌草对照药材1 g，加入甲醇20 mL，超声处理30 min(功率250 W，频率33 kHz)，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，即为对照药材溶液。按清解益肺苗方配比制备缺白花蛇舌草的阴性制剂，同供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。照薄层色谱法《中国药典》2020版四部附录(通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液、阴性样品溶液各5 μL，分别点于同一以0.5%羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上；以甲苯-丙酮-冰醋酸(8∶3∶0.3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝-乙醇溶液，在105 ℃加热3 min，置紫外光灯(254 nm)下检视[9]。结果显示3批供试品色谱中所呈现的荧光主斑点，在与对照药材色谱荧光斑点相应的位置上，显相同的颜色，且阴性对照无干扰。结果如图5所示。

1～3.供试品(20210728、20210729、20210730)；4.阴性对照溶液；5.白花蛇舌草对照药材

3 讨论

清解益肺苗方颗粒由12味药组成，参照2020年版《中国药典》相关质量标准及相关文献对处方中黄芪、南沙参、余甘子、鱼腥草、白花蛇舌草五味药材进行薄层鉴别研究，实验结果显示本文建立的方法专属性强，稳定性及重现性好。

前期根据药典标准对五味药材进行薄层鉴别研究，只有黄芪斑点清晰且无阴性干扰外，其余4味药材斑点显色均不清晰；后期参考相关文献资料，进一步对南沙参、余甘子、鱼腥草和白花蛇舌草四味药材进行薄层鉴别研究，结果显示斑点清晰，分离度好且无阴性干扰。余甘子在鉴别过程中，对硅胶板及展开剂进行考察，结果显示以硅胶GF254薄层板，石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯-甲酸(5.5∶4.5∶0.25)为展开剂，分离效果显著提高，且斑点显色清晰。白花蛇舌草考察了不同的显色剂，结果用5%三氯化铝-乙醇溶液作为显色剂时，斑点显色更为清晰。结果证明上述五味药材的薄层鉴别研究可作为清解益肺苗方颗粒的质量控制方法。但因为中药复方制剂成分复杂，不同的中药可能含有相同的成分，单凭化学物质对照品难以辨别，故实验建立的薄层鉴别方法均采用对照药材来鉴别。为建立清解益肺苗方颗粒的质量控制方法提供了思路，也为其临床用药安全有效提供了参考价值。