硝酸甘油气雾剂皮肤给药抗异丙肾上腺素所致大鼠心肌缺血的实验研究

谢金根,李文宏（江西中医药大学,江西 南昌 330004）

缺血性心脏病（IHD）是当前心血管疾病最主要的死亡原因之一，仅在2019年，因IHD死亡的患者高达914万例[1]，IHD以心肌缺血为表征，临床多出现心绞痛、心肌梗死等症状[2]。目前临床治疗IHD主要是通过溶栓、冠状动脉旁路移植术等方式改善缺血情况[3]，但心肌在缺血时可能已经发生病变，在重新供血供氧的情况下病变心肌可能会因为能量代谢异常，不可避免地加重原本受损的心脏[4-5]。

硝酸甘油是血管扩张剂，可以迅速改善缺血心肌的供血供氧，有效缓解心绞痛及其相关的疼痛[6]，同时降低心脏前负荷，降低心肌耗氧量，是心血管疾病最常用的药物[7]，已有一个多世纪的应用历史，其剂型也多种多样，国内外市场上较常用的剂型包括注射剂、透皮贴剂、片剂、气雾剂等。其中气雾剂具有使药物均匀分散，起效快，生物利用度高，能避免肝脏的首过效应等优点，在局部用药时常优于其他剂型[8]。硝酸甘油气雾剂常规用药部位为舌下给药，但生物利用度个体差异大，达到最大血药浓度后迅速下降，作用维持时间短，且不适用于心绞痛发作时的晕厥患者。经皮给药虽然吸收较差、不规则，但作用维持时间长，适用于预防心绞痛的发作或牙关紧闭的晕厥患者。本研究主要考察硝酸甘油气雾剂皮肤给药对心肌缺血的影响，为硝酸甘油气雾剂皮肤给药合理性提供理论依据，提高临床治疗水平。

1 材料与方法

1.1 仪器 BL-420F生物信号采集处理系统（成都泰盟科技有限公司）；生物组织石蜡包埋机（德国Leica公司）；轮转式石蜡切片机（德国Leica公司）；恒温摊片机（德国Leica公司）；ELX800吸收光酶标仪（美国BioTek仪器有限公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；恒温烘箱（上海一恒科学仪器）；离心机（湖南湘仪）。

1.2 药物及试剂 硝酸甘油气雾剂（济宁为民制药有限公司）；异丙肾上腺素注射液（上海禾丰制药有限公司）；水合氯醛（麦克林）；苏木精-伊红染色液（南昌雨露实验器材有限公司）；SOD、GSH-PX、MDA生化试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 试验动物 36只健康成年SPF级雄性SD大鼠（250g-300g）由北京科瑞斯实验动物有限责任公司提供，动物合格证号SCXK（京）2019-0010。饲养条件：室温为23℃-25℃，相对湿度（55%±10%），明暗条件（12/12明暗比），自由饮水、喂饲。

1.4 方法

1.4.1 动物分组 将36只雄性SD大鼠随机分为正常组、模型组、舌下给药组（0.1mg/kg）、皮肤给药组（低、中、高剂量组分别为0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.9mg/kg）共六组，每组6只。

1.4.2 造模、给药以及心电图的采集 大鼠腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后固定于鼠板上，左胸备皮，四肢插入大头针连接生物信号采集处理系统检测，记录大鼠Ⅱ导联心电图10min，剔除心律异常的大鼠后，随机分组。正常组于皮下多点注射等体积的生理盐水，其余各组给予5mL/kg ISO造模后，正常组和模型组经皮给予等体积的无水乙醇，给药组按照不同给药部位给予相应剂量硝酸甘油，每天一次，连续三天。第三天麻醉、记录心电图10min后，同上法复制心肌缺血模型，并给予相应受试药物，记录心电图30min，观察J点（QRS波群的终点与ST段交接处）变化的绝对值（|ΔJ|），|ΔJ|=|给药后J点值-造模前J点值|。

1.4.3 大鼠血清及心肌组织样本提取与保存 心电图采集结束后，腹主动脉取血，静置2h，3500r/min离心10min，吸取上清液分装，-80℃保存备用。采血后，打开胸腔，迅速摘取心脏，以预冷PBS洗尽残血，放置于4%的多聚甲醛固定48h。

1.4.4 大鼠血清中SOD、GSH-PX、MDA含量测定 严格按照试剂盒使用说明检测血清超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）和丙二醛（MDA），酶标仪检测吸光度。

1.4.5 HE染色观察大鼠的心肌组织病理学变化 取同一位置的心肌组织，乙醇（75%、85%、95%、100%）梯度脱水；后经二甲苯透明；充分浸蜡、石蜡包埋；切片机切片、摊片，每例动物切3片，切片厚度5µm；石蜡切片置于恒温箱中60℃烤片1h；迅速使用二甲苯脱蜡；乙醇（100%、95%、85%、75%）梯度水化；苏木素染核；1%盐酸分化，2%碳酸氢钠反蓝；85%乙醇脱水；伊红染质；100%乙醇脱水；二甲苯透明；中性树脂封片，倒置显微镜观察拍照，观察心肌组织的病理状态。

2 结果

2.1 硝酸甘油气雾剂对ISO致大鼠心肌缺血心电图的影响 与正常组相比，模型组的|ΔJ|显著增加（P＜0.01）；与模型组相比，舌下给药组的|ΔJ|在给药后显著降低（P＜0.01），在给药30min时，|ΔJ|有所回升；低剂量组的|ΔJ|在给药后逐渐下降，且在30min时显著降低（P＜0.01）；中剂量组的|ΔJ|在给药15min时显著降低（P＜0.01），30min时没有回升趋势；高剂量组|ΔJ|在给药15min时显著降低（P＜0.01），但|ΔJ|在30min时有所回升。见表1。

表1 硝酸甘油气雾剂对ISO致大鼠心肌缺血的|ΔJ|影响(±s,n=3)

表1 硝酸甘油气雾剂对ISO致大鼠心肌缺血的|ΔJ|影响(±s,n=3)

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

|ΔJ|2min 5min 15min 30min正常组 - 0.007±0.031 0.005±0.024 0.009±0.025 0.007±0.013模型组 - 0.208±0.029## 0.209±0.025## 0.203±0.011## 0.215±0.016##舌下给药组 0.1 0.066±0.038** 0.033±0.030** 0.073±0.051** 0.135±0.029低剂量组 0.1 0.147±0.022 0.125±0.016* 0.113±0.032* 0.013±0.050**中剂量组 0.3 0.131±0.039 0.105±0.033* 0.070±0.054** 0.050±0.064**高剂量组 0.9 0.180±0.025 0.117±0.002* 0.075±0.017** 0.151±0.026组别 剂量（mg/kg）

2.2 SOD活力 如图1所示，与正常组相比，模型组SOD活力降低（P＜0.05）；与模型组相比，给药组SOD活力显著升高（P＜0.01）。

2.3 GSH-PX活力 如图2所示，与正常组相比，模型组GSH-PX活力显著降低（P＜0.01）；与模型组相比，给药组GSH-PX活力显著升高（P＜0.01）。

2.4 MDA含量 如图3所示，与正常组相比，模型组MDA含量升高，但无统计学差异；与模型组相比，高剂量给药组有显著性差异（P＜0.01），其余给药组MDA含量有下降趋势，无统计学意义。

2.5 硝酸甘油气雾剂对ISO致大鼠心肌缺血的心脏组织形态的影响 如图4所示，正常组的心肌细胞结构完整，细胞膜正常，绝大部分心肌纤维排列正常，未见炎性细胞浸润、纤维变性和坏死；模型组心肌细胞空泡化严重、间质水肿、部分心肌纤维排列紊乱、断裂、束膜溶解卷曲、炎性细胞浸润、核仁不明；与模型组相比，各给药组心肌细胞空泡化减少、心肌纤维排列紊乱、断裂、束膜溶解卷曲情况得到改善，炎症反应减轻。

根据心脏病理特征综合评分[9-10]，选取五个评分项（心肌细胞空泡化，心肌细胞间质出血和水肿，心肌纤维排列紊乱、断裂，炎性细胞浸润，心肌细胞坏死、自溶）。参照病理实验结果，按心肌损伤严重程度进行评分，每个评分项最低得分0分，最高得分3分：无病变者记0分；轻度损伤者记1分；中度损伤者记2分；重度损伤者记3分。统计每组样本评分项的总分，分值越高代表心肌损伤越严重。见表2。

表2 硝酸甘油气雾剂对ISO致大鼠心肌缺血的心脏组织形态的影响(n=6)

3 讨论

心肌缺血是指心脏的血液灌注量减少、心肌供氧量不足，导致能量代谢异常，心脏不能正常工作的病理状态[11]。ISO是一种合成儿茶酚胺类β肾上腺素受体激动剂，过量或长期使用时可产生高度细胞毒性的自由基引起心肌严重氧化应激，造成不可逆转的细胞损伤，从而导致以室性期前收缩为表现的缺血性心律失常[12-13]。本研究通过皮下多点注射ISO的方式制造大鼠心肌缺血模型，以|ΔJ|≥0.1mv视为心肌缺血造模成功[14]。实验结果显示，与模型组相比，硝酸甘油给药组均可降低|ΔJ|值，其中舌下给药组起效时间最快，皮肤给药组随着剂量的增加，起效时间也在减慢；同时各给药组心肌细胞空泡化减少、心肌纤维排列紊乱、断裂、束膜溶解卷曲等症状得到改善，炎症反应减轻。因此，硝酸甘油气雾剂皮肤给药可能通过皮肤渗透到血液中，产生与舌下给药相同的药理作用，发挥对心肌组织的保护作用。

在缺血性心律失常中活性氧（ROS）的过度产生起重要作用，丙二醛（MDA）是体内ROS过氧化生物膜中的多价不饱和脂肪酸产生而形成的脂质过氧化终产物，SOD和GSH-PX是体内清除ROS的关键酶[5]，其活性的变化可以反映机体清除ROS、抗氧化损伤能力。实验结果显示，硝酸甘油给药组的大鼠血清中SOD、GSH-PX活力明显升高（P＜0.05），MDA含量都有下降趋势，表明硝酸甘油气雾剂可能通过升高SOD、GSH-PX等内源性氧自由基清除酶的活性，增加其抗氧化能力，减轻病变心肌的氧化应激。

硝酸甘油作为心脑血管疾病常用药物，临床上治疗多为舌下给药，吸收速率快，能够迅速发挥疗效，缓解症状。本研究发现，硝酸甘油气雾剂能通过皮肤降低|ΔJ|值，维持心肌组织结构完整，通过提高大鼠血清SOD、GSH-PX的活力，降低MDA的含量来发挥对心肌的保护作用。并且随着给药剂量的增大，发挥作用的时间以及症状情况会随之改善。有研究表明，随着硝酸甘油的剂量增加，对冠心病心绞痛临床治疗的疗效也会随之增加，且不会增加药物的不良反应[15]。在皮肤给药中，也许可以根据症状，适当增加给药剂量，达到最佳疗效。值得注意的是：在本实验过程中，给药组大鼠均出现死亡现象，其中皮肤给药组各死亡3只，舌下给药组死亡1只，其原因可能是硝酸甘油主要通过上调NO/cGMP通路而舒张血管平滑肌，导致血压过度下降，并会反射性引起交感神经兴奋，加重心脏负担，增加ISP的心脏毒性而出现死亡，具体原因，还有待深入研究。