微小RNA132 在突触可塑性以及药物成瘾中的作用*

林晓瑞，霍昱，樊响，孙琳琳，李亦婧

（北京大学神经科学研究所/北京大学基础医学院神经生物学系/神经科学教育部重点实验室和国家卫生健康委员会神经科学重点实验室，北京 100191）

药物成瘾是一种由于长期使用成瘾性药物使大脑结构和功能发生适应性变化，导致不顾消极后果的强迫性觅药和用药的慢性精神脑病[1]。即使在脱毒很长时间之后，药物相关线索仍能引发复吸，表明成瘾代表了一种病态而又顽固的学习和记忆形式[2]。成瘾性药物可以诱发奖赏和记忆相关脑区神经元的突触结构和功能发生可塑性变化，这种突触可塑性对于成瘾记忆的获得、巩固、提取，再巩固和消退等过程至关重要，并最终导致长期的觅药和用药行为[3]。目前，药物成瘾发生的确切分子机制仍然不清楚。

miRNA 是一种非编码RNA，其长度约为21个核苷酸且进化保守[4]。miRNA 可以在转录后水平发挥调控基因表达的作用：miRNA 在胞质组装成RNA 诱导的沉默复合物后，于核糖体中与靶基因转录的mRNA 的3'端非翻译区（Untranslated region, UTR）识别并特异性互补，导致mRNA 降解或翻译阻滞[4,5]，从而参与调控真核生物多种生理过程。在目前已发现的miRNA 中，miR-132是研究较多的参与调控突触可塑性的miRNA[6]。miR-132 在啮齿动物脑组织尤其是海马中表达丰富[7]，它也被证明与海马依赖的空间记忆和条件化记忆行为密切相关[8,9]。本文将对miR-132 在突触可塑性和学习记忆行为中的调控作用以及近年来miR-132 在药物成瘾领域的发现进行综述，以探讨miR-132 在药物成瘾记忆研究中的潜力，为后续相关研究提供参考。

1 miR-132 的基本情况

miR-132 基因位于人17 号染色体，小鼠11 号染色体和大鼠的10 号染色体的基因间区域，在脊椎动物中显示出高度保守性[10,11]。miR-132和miR-212 同属一个miR-132/212 基因簇（miR-132/212 cluster）。cAMP 反应元件（cAMP response element, CRE）被 证 实[7]处 于miR-132 和miR-212 的共有调节区域，提示miR-132 和miR-212均受cAMP 反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein, CREB）信号转录调控。细胞核内miR-132/212 基因簇转录为一个长的初级转录本pri-miR-132/212（101 bp），随后加工成茎环结构的前体pre-miR-132 和pre-miR-212 转运到细胞质，被酶切形成约20 bp 的miRNA 成熟体[4,12]。miR-132 的 成 熟 体 包 括miR-132-5p 和miR-132-3p，分别从pre-miR-132 的5'端臂和3'端臂加工而来。

2 miR-132 与突触可塑性

2.1 miR-132 在树突中表达丰富

研究表明，部分miRNA 的前体和成熟体[13]以及miRNA 加工所需要的核糖体[14]和RNA 结合蛋白[15]在树突中表达。单突触水平光刺激分解释放谷氨酸诱发兴奋性突触后电流（双光子谷氨酸解笼锁实验）能促进树突中miRNA 的前体加工，迅速增加miRNA 成熟体水平，并进一步导致树突局部靶基因蛋白合成减少[16]。该结果提示miRNA可能会通过调控树突局部的靶基因的mRNA 水平，改变突触可塑性来响应快速变化的神经元活动。例如，高丰度表达在大鼠海马神经元树突中的miR-134 能通过抑制树突中LIM 激酶1（LIM Kinase l, LIMK-1）的表达来减少树突棘的头部宽度，而胞外的刺激比如脑源性神经营养因子能解救miR-134 对LIMK-1 的翻译抑制[17]。

miR-132 在胞体和突触中都有表达[18,19]。在大鼠海马齿状回中，miR-132 在突触连接体（synaptoneurosomes, 脑组织匀浆提取到的保留着突触前后成分和功能特性的封闭神经末端结构）中表达比较高，说明miR-132 在树突和轴突中表达丰富[20]。据此，可以推测定位于树突的miR-132 能及时响应突触活动的变化，下调突触局部蛋白的表达水平，从而调控突触可塑性和记忆形成。

2.2 miR-132 调控树突的结构可塑性

miR-132 参与调节不同脑区的神经元树突及树突棘的结构与形态的改变。在miR-132/212 基因簇敲除小鼠的海马齿状回内，新生神经元的树突总长度变短，树突分支数目减少[21]，二级树突的树突棘密度降低[6]。幼年小鼠嗅球中，抑制miR-132 的表达可导致新生神经元树突复杂度下降，树突总长度变短，树突棘密度降低[22]。幼年小鼠视皮层中，抑制miR-132 的表达不影响锥体神经元树突树复杂度，但能导致树突棘密度降低[23]。在培养的大鼠海马神经元中，抑制miR-132 会导致神经元的树突树复杂度下降，树突棘密度不变[24]或者降低[25]。与此对应，幼年小鼠嗅球中，过表达miR-132 导致新生神经元树突复杂度、树突总长度增加和树突棘密度增加[22]。成年小鼠海马CA1 中，过表达miR-132 导致锥体神经元树突棘密度增加[9,26]。幼年大鼠的海马脑片中，过表达miR-132 导致海马CA1 锥体神经元的树突总长度增加[18]，树突棘密度增加[25]。而在培养的大鼠海马神经元中，过表达miR-132 可导致神经元的树突棘密度减少[24]。

树突棘可以根据形态特点进行划分，其中包括代表非成熟树突棘的丝状伪足型（filopodia）和代表成熟型树突棘的蘑菇型（mushroom），以及相对不成熟的瘦长型（thin）和相对成熟的粗短型（stubby）等[27]。miR-132 也能影响不同类型树突棘的比例。幼年小鼠视皮层中，抑制miR-132 的表达导致锥体神经元的蘑菇型树突棘比例减少，而丝状伪足型树突棘比例增加[23]。在青春期小鼠皮层中，过表达miR-132 导致皮层神经元的蘑菇型和粗短型树突棘比例增加[28]。在培养的大鼠海马神经元中，过表达miR-132 会导致神经元的粗短型和蘑菇型树突棘比例增加[24]，抑制miR-132导致丝状伪足型树突棘的密度增加[25]。

上述研究表明，miR-132 水平的变化可影响神经元树突棘形态和密度，甚至树突的结构，但其具体作用与实验动物的年龄、种属、检测的脑区相关，也和实验方法/对象等密切相关。在成年垂体腺苷酸环化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP） 缺 陷 小鼠的海马CA1 区中，神经元树突棘的密度显著低于野生型小鼠，过表达miR-132 可以显著增加PACAP 缺陷小鼠锥体神经元的树突棘密度，却使野生型小鼠的树突棘密度显著降低[29]。这一结果提示，在某些病理或基因缺陷的状态下可能存在miR-132 基础表达含量不足进而导致神经元的树突棘密度降低，此时提高miR-132 水平可能促进树突棘的形成，而miR-132 发挥促进树突棘形成的作用是具有适宜的浓度范围的，超过适宜浓度范围的miR-132 或可抑制树突棘的形成。

2.3 miR-132 调控功能可塑性

miR-132 可能通过调控树突棘的形态和数量，来改变突触传递的效能。研究表明，miR-132 对自发[19,22,25]和诱发[19,23,24,28,30]的突触传递有相对复杂的调控作用，在不同类型的细胞和神经环路中的记录到的结果可能不同。

首先，敲除或者抑制miR-132 的表达会影响海马神经元的功能可塑性。在miR-132/212 基因簇敲除的成年小鼠的海马中，CA1神经元记录到的 场 电 位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）的幅度明显降低，而配对脉冲比（Pairedpulse ratio, PPR）不变，提示敲除miR-132 导致基础突触传递效能减弱[6]。成年小鼠海马齿状回中，抑制miR-132 的表达不仅导致颗粒细胞的自发兴奋性突触后电流（spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC）频率降低（幅度不变），也能使刺激穿通通路诱发的颗粒神经元的兴奋性突触后电流（evoked-excitatory postsynaptic current，eEPSC）幅度显著减小，但PPR 不变[19]，提示突触前递质释放的可能性没有改变，eEPSC幅度下降是突触后改变所引起。在培养的大鼠海马神经元中，抑制miR-132 导致海马神经元中记录到的微小兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC）频率降低（幅度不变）[25]。据此推测，抑制miR-132 可能导致海马神经元突触数目减少，进而影响海马神经元的兴奋性突触连接。其次，过表达miR-132 也可影响海马神经元的功能可塑性。幼年小鼠嗅球内，过表达miR-132 导致新生神经元内自发抑制性突触后电流（spontaneous inhibitory postsynaptic current，sIPSC）的频率显著增加[22]。在培养的大鼠海马神经元中，过表达miR-132 会导致神经元的mEPSC 的频率和幅度增加[24]。

在其他脑区中，miR-132 的表达也可影响神经元的突触可塑性。在miR-132/212 基因敲除小鼠的躯体感觉皮层中，锥体神经元中的mEPSC 的幅度和频率降低[6]。幼年小鼠嗅球内，抑制miR-132的表达导致新生神经元中mEPSC 的频率和幅度以及sIPSC 的频率降低[22]。成年小鼠视觉皮层中，抑制miR-132 的表达导致皮层神经元mEPSC 的幅度降低（频率不变）[23]。

长时程增强（long-term potentiation，LTP）和长时程抑制（long-term depression，LTD）是神经元突触可塑性的两个典型表现。研究表明，LTD往往和树突棘数目减少、树突棘头部宽度减小、现存的树突棘去稳定化、突触减少以及突触连接性减弱相关[31]；而LTP 与树突棘数目增加、树突棘头宽度增加、瘦小型树突棘转换为蘑菇型或粗短型树突棘、新生成的树突棘稳定化、突触增多以及突触连接性增强相关[32,33]，miR-132 可能通过对树突棘形态的调控影响LTP 和LTD 的诱导或维持。例如，成年小鼠新皮质中，敲除miR-132/212 基因簇导致theta 脉冲刺激诱发的LTP 的幅度降低[6]。而海马内，敲除miR-132/212 基因簇导致theta 脉冲刺激诱发的CA3-CA1 通路的LTP的幅度增加[6]。也有研究发现[34]，成年小鼠海马内，过表达miR-132 导致高频电刺激诱导CA3-CA1 通路的LTP 幅度增加，伴有LTP 诱导阈值的降低。而在大鼠鼻周皮层内，过表达miR-132 可导致高频电刺激诱发的LTP 及卡巴胆碱诱发的LTD 幅度降低[35]。尽管上述研究发现的现象并不完全一致，但是由于LTP 和LTD 是学习记忆的重要机制，可以推测miR-132 可能通过对LTD 和LTP 的调控作用来长时间改变突触传递效能，从而参与学习记忆过程。

3 海马中miR-132 调控空间相关学习与记忆

3.1 海马中miR-132 水平与空间学习和记忆

多项研究显示，小鼠在空间记忆的形成与巩固过程中伴有海马内miR-132 水平的改变。Nudelman AS 等[36]将成年小鼠暴露于特定环境中并给予足底电击刺激，进行条件化恐惧记忆训练，训练后15 分钟，小鼠海马内pri-miR-132 水平显著增加，并在45 分钟后达到峰值（约为无训练小鼠的3.5 倍）；但对于仅暴露在特定环境中不接受足底电击刺激的小鼠，训练后30 分钟，其海马内pri-miR-132 水平也显著增加，水平与在该环境中接受足底电击刺激的小鼠相近，提示海马内miR-132 水平的增加很可能参与小鼠对空间情景的编码[36]。成年小鼠在巴恩斯迷宫空间记忆训练两天后，海马CA1、CA3 和齿状回内miR-132 水平显著增加（1.5 倍）[26]。另外，空间记忆损伤过程往往伴随有海马内miR-132 水平的下降。Karabulut S 等[37]对每天Morris 水迷宫训练后的成年小鼠进行快眼动睡眠剥夺，发现小鼠的空间记忆的形成和巩固能力严重损伤（寻找逃脱平台的时间并没有随训练过程显著减少，测试时在原逃脱平台象限停留时间显著减少），同时海马中miR-132 水平也是显著降低的（0.77 倍）。Hu XL等[38]研究表明，模拟慢性脑灌注不足的双侧颈总动脉闭塞（bilateral common carotid artery occlusion，2VO）的成年大鼠在Morris 水迷宫找到逃避平台的时间显著增加，测试时在原平台象限停留时间显著减少，同时伴随着海马中miR-132 水平显著下调（约为假手术对照组0.75 倍）。

3.2 调控miR-132 水平可影响空间学习和记忆

相比野生型小鼠，miR-132/212 基因簇敲除小鼠在巴恩斯迷宫训练过程中，发现逃脱箱的时间更长、进入逃脱箱的次数减少，测试时经过原逃脱箱位置的次数变少；在T 型水迷宫中，如将平台位置左右互换后，小鼠在规定时间内连续5 次到达平台所需要的实验次数增加[39]，结果提示miR-132/212 基因簇敲除会影响空间记忆的形成和提取过程。成年小鼠海马中，抑制miR-132 表达（约为对照组的0.5 倍），小鼠在Morris 水迷宫训练中需要更长时间找到逃避平台，测试时穿越原逃避平台位置的次数显著减少[40]。成年2VO 大鼠的海马中，过表达miR-132（约为假手术对照组的1.5 倍），2VO 大鼠在Morris 水迷宫训练过程中找到逃避平台的时间显著减少，测试时在原平台象限停留的时间更久[38]。Hansen KF 等[9,26]采用强力霉素诱导的基因表达系统来调控成年小鼠海马内兴奋性神经元中miR-132 水平，结果发现如将miR-132 上调至对照组2 倍，小鼠在巴恩斯迷宫训练过程中，找到逃脱箱的时间和失败的次数显著减少；如将miR-132 上调至对照组3 倍以上，小鼠在巴恩斯迷宫的训练过程中，找到逃脱箱的时间和失败的次数显著增加；如将miR-132 水平下调为对照组水平，则小鼠在巴恩斯迷宫实验中的认知障碍可以被逆转。以上研究提示，海马中miR-132 对小鼠的空间学习和记忆的促进作用是具有适宜浓度范围的。综合miR-132 发挥促进树突棘形成的作用也具有适宜的浓度范围（参考前述段落2.2），推测海马内miR-132水平的适度增加，促进树突棘形成，增强神经元的突触功能，从而有利于小鼠的空间学习和记忆。

4 药物成瘾与突触可塑性

4.1 成瘾药物改变大脑结构

成瘾药物可以使脑内编码奖赏特性及学习记忆相关脑区神经元的结构和功能发生适应性变化。影像学研究发现，海洛因依赖患者的左侧伏隔核核部体积显著缩小[41]，静息状态下伏隔核和前扣带回与眶额叶皮层的功能性连接显著增强[42]；慢性酒精滥用患者的左侧海马体积显著缩小[43]；脱毒治疗后复吸的可卡因成瘾患者的左后海马的基础神经元活动增强，左后海马与后扣带回的功能性连接增强[44]。

4.2 成瘾药物诱发海马突触可塑性

动物实验研究发现，药物成瘾过程中海马内神经元的突触结构和功能会发生显著可塑性变化。例如，海马CA1 和DG 神经元的树突棘密度，以及高频电刺激CA3-CA1 通路诱导的LTP随着成瘾进程、成瘾药物类型等因素会发生明显变化。慢性可卡因暴露和可卡因自身给药形成后，大鼠海马CA1 中锥体神经元的树突棘密度显著增加[45,46]。可卡因条件性位置偏爱（conditioned place preference，CPP）消退后，小鼠腹侧CA1 中锥体神经元树突棘密度显著降低[47]。吗啡自身给药末次训练1 个月后，大鼠海马CA1 锥体神经元和DG 颗粒细胞的树突棘密度显著降低。慢性酒精暴露后，大鼠海马CA1 锥体神经元树突棘密度降低，DG 颗粒细胞树突棘密度增加[48]。慢性可卡因末次给药3 天后而非14 天后，大鼠CA3-CA1 通路的LTP 幅度显著增加[49]。可卡因自身给药末次训练10 天后，大鼠CA3-CA1 通路的LTP 显著增加[50]；而可卡因自身给药末次训练3～5 周后，大鼠CA3-CA1 通路的LTP 显著降低[51]。吗啡CPP测试后，大鼠CA3-CA1 通路的LTP 幅度显著降低；吗啡CPP 消退后，LTP 恢复到与盐水组类似的水平；当吗啡CPP 重建后，LTP 的幅度反而会明显升高[52]。

4.3 干预海马突触可塑性可影响成瘾相关记忆

病理性成瘾记忆形成过程中，很重要的环节是将药物的奖赏效应与其感受奖赏效应时所处的空间线索进行联合性学习。而干预海马中神经元的突触可塑性改变对病理性成瘾记忆的形成、巩固和提取的影响仍有待进一步探索。研究发现[53]，可卡因CPP 记忆提取后，小鼠海马CA1 锥体神经元的树突棘密度增加，mEPSC 幅度增加，敲低即刻早期基因NPTX2可以逆转上述可塑性改变并抑制可卡因CPP 记忆的消退。可卡因CPP 记忆提取后，给予低频电刺激不能使theta 脉冲诱导的CA3-CA1 通路LTP 的幅度降低，但在可卡因CPP形成期间给予食欲素受体拮抗剂后，低频电刺激能使上述LTP 幅度降低，同时也能有效抑制CPP表达[54]。以上研究表明，海马神经元的突触可塑性在药物成瘾中发挥重要作用。

5 miR-132 与药物成瘾

近年来，关于miR-132 参与药物成瘾过程的研究基本局限在miR-132 水平的变化，对于成瘾过程中miR-132 如何调控成瘾相关行为，以及miR-132 上下游的分子机制并不十分清楚。

5.1 背侧纹状体中miR-132 在药物成瘾后的表达变化

急性可卡因注射即可显著增加小鼠纹状体中pri-miR-132 水平[36]。背侧纹状体包括尾状核（caudate putamen nucleus，CPu）和壳核。可卡因自身给药形成后或可卡因被动给药后，大鼠CPu中miR-132 水平相比盐水被动给药组均显著降低。可卡因长时程自身给药（extended access）形成后，大鼠背侧纹状体中miR-132 水平相比不给药对照组（压杆不给予可卡因）和短时程自身给药（restricted access）组显著增加[55,56]。另有研究表明[57]，可卡因自身给药形成后，大鼠背侧纹状体中miR-132 水平显著高于盐水被动给药组，略高于可卡因被动给药组。可卡因自身给药消退后，大鼠背侧纹状体中miR-132 水平依旧显著高于盐水被动给药组和可卡因被动给药组[57]。此外，安非他命慢性暴露后，青春期大鼠的背侧纹状体而非伏隔核中pri-miR-132 水平显著增加[58]。

目前，尚无调控背侧纹状体中miR-132 影响成瘾相关行为的研究。但上述可卡因自身给药的研究中，背侧纹状体中miR-212 表达水平的变化方向和miR-132 基本一致[55-57]，提示两者可能发挥相似的作用。miR-132 和miR-212 从同一个初级转录本转录并加工，两者序列相似，潜在靶基因互有重叠，功能也相似，因此miR-212 在成瘾领域相关的研究也许能为miR-132 的研究带来一定启示。研究表明[56]，在可卡因长时程自身给药的大鼠的背侧纹状体中，过表达miR-212 不仅降低大鼠的压杆次数而减少可卡因的摄入量，而且显著减少每次给药后不应期内无效的压杆次数。反之，抑制miR-212 的表达则逆转上述现象，提示miR-212 在可卡因强迫性用药行为中发挥重要作用。该结果为后续进行以miR-132 为靶点从而调控成瘾行为的研究提供了一定参考作用。

5.2 伏隔核中miR-132 在药物成瘾中的作用

miR-132 水平的变化在伏隔核各亚区不同，且与成瘾的进程相关。伏隔核分为壳部和核部，其中 伏 隔 核 核 部（nucleus accumbens core，NAc core）主要与早期奖赏反应相关，而伏隔核壳部（nucleus accumbens shell，NAc shell）和习惯性觅药行为相关。可卡因自身给药形成后，大鼠NAc core 中miR-132 水平相比盐水被动给药组显著降低；而自身给药行为消退并重建后，易成瘾的大鼠的NAc shell 中miR-132 水平相比成瘾耐受大鼠显著增加[59]。此外，慢性海洛因暴露大鼠的伏隔核中，miR-132 水平显著降低[60]。Cahill ME 等[61]研究表明，在小鼠伏隔核中敲低miR-132/212 基因簇能显著增强低剂量可卡因（不足以训练行成CPP 的剂量）的奖赏效应和情景线索的联合，使小鼠对可卡因伴药箱产生明显偏爱。以上结果提示伏隔核的miR-132/212 参与可卡因成瘾记忆的形成和提取过程。

5.3 海马中的miR-132 在药物成瘾中的作用

可卡因长时程自身给药形成后，大鼠海马中miR-132 和miR-212 的表达相比不给药对照组显著增加[56]。吗啡依赖大鼠的海马齿状回中，miR-132 和miR-212 的表达显著高于盐水对照组[62]。既往研究发现[63]，大鼠吗啡自身给药训练过程中，在海马齿状回神经干细胞中过表达miR-132，可以加速自身给药行为的习得并抵抗其消退。miR-132可能通过增强海马齿状回内新生神经元树突树的复杂度和树突的总长度从而促进神经干细胞的分化，最终调控吗啡成瘾行为[63]。此外，在吗啡依赖大鼠的海马齿状回神经元中抑制miR-132 的表达能显著减轻吗啡的戒断症状，并翻转吗啡依赖后齿状回神经元结构可塑性改变[62]。这些研究提示miR-132 对突触可塑性的调控作用可能是miR-132 参与成瘾的机制。

5.4 其他脑区中miR-132 在药物成瘾后的表达变化

可卡因长时程自身给药形成后，大鼠小脑中miR-132 水平相比不给药对照组和短时程自身给药组显著上调，而在成瘾相关的其他脑区包括前额叶皮层和腹侧被盖区中，miR-132 水平没有显著变化[56,64]。此外，可卡因依赖患者的脑组织中，miR-132 水平显著升高[65]，提示miR-132 可以作为临床上因服用可卡因引起的脑损伤的标志物。

6 结语

综上所述，过往的研究从树突形态、功能可塑性和学习记忆等多个角度证实了miR-132 在成瘾记忆研究中的巨大潜力。然而，关于miR-132 在成瘾领域的研究大多限于表达水平的变化，miR-132 表达发生变化的机制并不清楚，以及miR-132通过哪些靶基因调控成瘾的发展过程仍旧缺乏研究。因此，深入研究miR-132 是否能通过调控突触可塑性，从而影响成瘾相关记忆的形成、提取、消退或重建，对于消除顽固性的药物成瘾记忆、寻找成瘾治疗的关键靶分子的探索与研究有重大的意义。