缺血性脑卒中：褪黑素保护作用的新进展

史 梅综述， 谷有全审校

卒中是全世界人类死亡和长期残疾的主要原因，其中缺血性脑卒中是由向脑组织提供氧气和营养的血管狭窄或闭塞引起的。由于脑组织高速消耗能量，血液供应不足导致大脑稳态失调，从而导致氧化应激、兴奋性毒性、炎症、血液-脑脊液屏障的破坏以及外周免疫细胞向缺血中心区的渗透[1]。目前，重组人组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)静脉溶栓和血管内治疗是其优选的治疗方法。然而，因为这些治疗具有时间窗的限制，并非所有患者都能从中受益。近年来，褪黑素在脑血管疾病领域有了许多突破性的研究，本文将围绕褪黑素抑制自由基产生和减轻氧化应激、信号转导通路、减轻脑水肿及联合其他药物治疗脑缺血方面进行综述。

1 褪黑素在脑缺血中的作用

褪黑素在松果体中合成，释放到血液和脑脊液中以发挥调节作用、控制昼夜节律，参与多种生理过程，包括情绪行为、血压调节、卵巢生理和成骨细胞分化[2]。大量研究表明褪黑素与多种神经系统疾病有关，包括卒中、创伤性脑损伤、阿尔茨海默病和帕金森氏病等，且人们发现，血清和脑脊液褪黑素水平与年龄呈负相关[3]。

2 褪黑素在脑缺血时抑制自由基产生和减轻氧化应激

成年人的大脑只占总体重的2%，但却获得了总心输出量的15%，消耗了总摄氧量的20%。中枢神经系统具有相对较低的内源性抗氧化水平。氧化应激(Oxidative Stress，OS)是脑组织缺血导致早期损伤的重要组成部分，与在病理条件下由于自由基(Free Radicals，FR)的过度形成而产生的兴奋性毒性一起产生氧化和亚硝化应激，进一步损伤脑组织，造成神经功能异常。褪黑素通过非受体介导或增加抗氧化酶的活性和表达对活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)、活性氮簇(Reactive Nitrogen Species，RNS，)起到强大的清除作用[4]。此外，羟自由基在脑缺血中加重神经毒性，引起DNA损伤、ATP耗竭，褪黑素可以减轻脑组织缺血再灌注后产生的羟自由基依赖性损伤。ROS的产生涉及许多生物过程，NADPH氧化酶(NADPH Oxidases，NOX)被证明是ROS产生的主要催化酶，NOX2和NOX4是缺血性卒中大鼠脑组织ROS产生的主要亚型，可以诱导脑缺血再灌注模型大鼠的神经元凋亡和脑损伤，而褪黑素可以降低NOX2、NOX4的表达，从而降低ROS水平[5]。再者，谷胱甘肽可提高胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)活性，降低丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量，增强机体清除自由基的能力，减少大鼠脑组织氧自由基的堆积，在脑缺血条件下，谷胱甘肽的水平降低，给予褪黑素后可以观察到谷胱甘肽水平显著恢复[6]。此外，褪黑素还可以减少引起脂质过氧化和DNA损伤的大脑应激标志物，如MDA以及其他硫代巴比妥酸反应物质(Thiobarbituric Acid Reactive Substances，TBARS)[7]。

3 参与褪黑素对脑缺血神经保护作用的信号转导通路

脑缺血启动了很多的病理级联反应，其中的每一步都是通过多条途径进行调节的。褪黑素可以通过调控不同信号通路来参与脑缺血的病理生理过程。

3.1 褪黑素受体及其激动剂 褪黑素受体广泛分布于中枢神经系统和外周器官。褪黑素受体有2种亚型，分为 MT1 和 MT2 型，这两种受体均属于G蛋白耦联受体，在中枢神经系统广泛分布。褪黑素受体可以快速激活多种信号级联，随后触发保护作用，减轻缺血诱导的炎症、氧化应激和线粒体功能障碍。MT1的激活导致多种G蛋白的刺激，抑制环磷酸腺苷(cyclic Adenosine Monophosphate，cAMP)依赖的信号转导，降低蛋白激酶A(PKA)活性。同时，褪黑素受体MT2与多种信号转导通路偶联，包括磷脂酰肌醇的产生、腺苷酸环化酶(Adenyl Cyclase，AC)的抑制和可溶性鸟苷酸环化酶(soluble Guanylyl Cyclase，sGC)途径的抑制[8]。近年来，褪黑素受体激动剂引起了研究者们的兴趣。阿戈美拉汀是褪黑素MT1/MT2受体的激动剂，它的抗氧化和抗炎作用类似于褪黑素。Wijitra等[9]首次发现阿戈美拉汀治疗显著减少了神经细胞的凋亡，降低了促凋亡蛋白Bax和caspase-3的水平，增加了抗凋亡蛋白Bcl-2的水平，同时减少了神经元细胞凋亡，并且发现阿戈美拉汀显著增加血红素加氧酶1(Heme Oygenase-1，HO-1)、抗氧化酶的表达和SOD的活性，通过激活抗凋亡及抗氧化途径有效减轻脑缺血再灌注引起的神经元损伤。近期进一步发现阿戈美拉汀可以通过调节Nrf2/HO-1途径减轻永久性脑缺血后的脑损伤[10]。

3.2 钙离子水平及钙离子蛋白的调节 钙离子是细胞内最重要的第二信使之一，对细胞内稳态的维持至关重要。褪黑素除了能清除线粒体中的FR和减少FR的形成外，还能有效地防止Ca2+稳态失调。在缺血再灌注条件下细胞内Ca2+超载，Ca2+被重排到内质网和线粒体，过量的Ca2+聚集在线粒体基质中会扰乱生物能量学，刺激线粒体产生ROS，并导致线粒体膜通透性增加、功能受损和塌陷。过量的Ca2+也会激活多种钙依赖性的酶促蛋白，促进细胞骨架降解和自由基生成，引起细胞死亡或凋亡[11]。此外，动脉粥样硬化钙化的原因包括基质代谢失调、矿物质沉积、炎症、氧化应激和细胞凋亡，血管钙化主要由血管平滑肌细胞介导，褪黑激素通过AMP激活AMPK/OPA1途径促进线粒体融合或有丝分裂，或通过AMPK/mTOR/ULK1途径激活自噬，从而保护血管平滑肌细胞免于钙化[12，13]。Hussain等发现褪黑素可能通过降低小电导Ca2+激活的K+通道的表达来改善脑低灌注大鼠的记忆缺陷[14]。

3.3 抗细胞凋亡 细胞凋亡的诱导和调节是复杂的，这一过程涉及一系列凋亡相关因子和信号转导途径。揭示神经元凋亡的机制，减少脑缺血后神经元的凋亡是非常重要的。作为细胞的动力来源，线粒体在介导哺乳动物细胞的凋亡途径中发挥重要作用，线粒体的膜通透性受促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族成员的调节。当脑缺血再灌注发生时，Bcl-2表达减少，促凋亡因子Bax表达增加，细胞色素c通过线粒体外膜释放，参与形成凋亡小体，最终导致细胞凋亡[15]。褪黑素通过增强沉默信息调节因子-1(Sirtuin 1，SIRT1)的表达来诱导Bcl-2的上调和Bax的减少来保护神经形态和功能免受破坏，并起到脑保护作用[16]。褪黑素抑制线粒体通透性转换孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore，MPTP)的开放，减少细胞色素C、Caspase的表达，减少细胞凋亡[17]。近些年，有研究发现褪黑素可以抑制内质网应激引起的细胞凋亡[18]。这些发现证明了褪黑素通过与凋亡级联相关的各种机制发挥强大的抗凋亡作用。

3.4 PI3K/Akt的调控 PI3K/Akt信号通路调控多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、存活和凋亡。生存因子激活Akt，Akt通过磷酸化激活转录因子来促进细胞存活，抑制凋亡。肿瘤抑制转录因子p53可介导缺血性卒中后神经元损伤[19]，褪黑激素通过PI3K/Akt途径抑制p53磷酸化，增加神经元存活。有研究发现褪黑素在激酶催化区域Thr308位点上能更大程度的激活PI3K/Akt信号通路[20]。此外，γ-烯醇化酶，也称为神经元特异性烯醇化酶(Neuron-Specific Enolase，NSE)，是直接评估神经元损伤和修复程度的重要分子。NSE通过激活PI3K/Akt信号通路来控制神经元存活、分化和轴突再生，而褪黑素可以增强NSE的神经营养活性，使NSE通过激活下游靶点(PI3K/Akt)从而产生神经保护作用[21]。

3.5 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases，MMP)是细胞外基质重塑、组织形态发生和伤口愈合所必需的物质。然而，在再灌注期间，金属蛋白酶水平的上调会导致血脑屏障的破坏和炎症。脑周细胞是中枢神经系统MMP-9的主要来源。褪黑素通过内源性MMP抑制剂和纤溶酶原/纤溶酶系统的双重调节，有效抑制缺血后MMP‐9的激活和表达。在大脑中动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO)动物实验模型中，较长给药时间及较高剂量的褪黑素对MMP-9的活性和表达都有明显的抑制作用[22]。此外，褪黑素增强血脑屏障的完整性，可能是通过减弱IL-1β调节周细胞NOTCH3/NF-κB信号通路实现的[23]。

3.6 SIRT1 Sirtuins是一类烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinu-cleotide，NAD+)依赖性组蛋白和非组蛋白去乙酰化酶，由7个成员组成(SIRT1至SIRT7)。2014年，Carloni[24]首次证明，褪黑素在缺氧缺血后保留了神经细胞中SIRT1的表达。褪黑素诱导的sirt1激活通过改善p53和Nf-κb的乙酰化，并促进脑中的抗凋亡信号，从而起到脑保护作用。另外，小胶质细胞是缺氧损伤的早期反应者，能严重影响神经元的功能，在动物模型中，褪黑素可在缺氧条件下抑制小胶质细胞促炎极化，这种作用最近被证明依赖于SIRT1及其下游的AMPK途径[25]。除了缺血性脑损伤，在蛛网膜下腔出血模型中，褪黑素通过受体依赖机制改善神经功能评分，减轻脑水肿和神经细胞凋亡，这一过程是通过SIRT1/NF-κB信号通路增加Bcl-2的表达，降低Bax的表达实现的[26]。

3.7 SIRT3 最近的研究数据表明，除SIRT1外，SIRT3也与缺血性卒中相关，当脑组织缺血缺氧发生时，脑中SIRT3表达下调[27]。国内一项研究发现，短暂大脑中动脉闭塞模型中，褪黑素可以通过激活SIRT3信号通路，促进SIRT3的表达，减轻脑缺血再灌注损伤[28]。另外，褪黑激素可能通过STAT3途径调节小胶质细胞和巨噬细胞向抗炎方向趋化来预防缺血性卒中[29]。

4 褪黑素与脑水肿

脑水肿是脑梗死致死的重要原因之一。缺血性损伤后，由于细胞内积累的溶质如钠、氯化物等引起的细胞肿胀，以及细胞外含水量的升高，导致颅内压升高，从而导致脑血流量的减少，进一步增加了缺血、颅内内容物突出、脑结构损伤、神经损伤甚至死亡。褪黑素可以改变水肿相关分子的转录活性，对缺血缺氧后脑组织具有保护作用，而水肿相关蛋白如水通道蛋白(Aquaporin 4，AQP4)、闭锁小带蛋白1(Zonula Occludens 1，ZO-1)可能间接促成了褪黑激素的水肿保护机制[30]。

5 褪黑素联合其他药物或方法治疗脑缺血

褪黑素在许多疾病中的治疗价值是众所周知的，褪黑激素与其他药物结合，可能会得到1+1大于2的结果，给卒中治疗提供新思路。

5.1 联合地塞米松 褪黑素和地塞米松联合治疗在减轻脑水肿、避免星形胶质细胞浸润、抑制凋亡和金属蛋白酶以及减少诱导型一氧化氮合酶表达方面提供了比单一药物更大的有益效果[31]。

5.2 联合美金刚 非竞争性NMDA受体阻滞剂美金刚，一种已知的神经保护剂，褪黑素和美金刚单独或联合使用可明显减轻缺血损伤。在应激激酶p21、p38/MAPK和SAPK/JNK1/2通路失活中表现出减轻脑组织损伤的协同作用，特别是减少脑细胞的凋亡[32]。

5.3 联合硒 硒具有清除FR的能力，通过参与抗氧化防御和氧化还原平衡调节大脑功能，可通过激活抗氧化酶的活性，减轻脂质过氧化作用保护脑组织。Ahmad等[33]在短暂性局灶性脑缺血模型中同时给予亚硒酸钠和褪黑素，通过抑制诱导型一氧化氮合酶(inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS)表达，抑制炎症反应，抗细胞凋亡来改善神经功能。

5.4 联合针刺 针刺具有抑制炎症反应、减轻脑组织损伤和水肿、促进神经再生的作用，国内一项研究[34]证明了在大鼠短暂性局灶性脑缺血模型中，褪黑素结合电针(刺激强度0.5 mA，刺激频率2 Hz)可以显著改善神经功能，包括减少梗死体积、脑部炎症和TUNEL阳性细胞。

5.5 联合黄体酮 黄体酮参与卒中的病理生理过程，包括水肿形成、神经毒性、血脑屏障破坏、细胞凋亡、炎症反应和线粒体功能。Hedayatpour等[35]发现在大鼠脑缺血再灌注模型中，联合给予黄体酮和褪黑素可以增加锥体神经元的存活并减少海马CA1区的抗精神病因子，从而减少神经元死亡来增强学习和记忆等执行功能。根据这一研究结果，黄体酮和褪黑素的联合可能是治疗短暂性全脑缺血的潜在靶点之一。

5.6 联合氧疗 常压氧具有神经保护作用，可增加脑组织中的氧分压，改善有氧代谢，减少对血脑屏障(Blood-Brain Barrier，BBB) 的损伤，并减少急性缺血性卒中动物模型的缺血性脑损伤和梗死体积。常压氧和褪黑素联合治疗可以通过减少梗死体积、减轻脑组织肿胀、减少细胞凋亡显著改善缺血核心和半暗带的脑血流量，从而降低脑缺血的神经缺损功能评分[36]。

高压氧治疗改善缺血相关器官功能障碍的机制可能主要是通过使缺血区氧压升高(即短暂的高氧)、增加血管壁通透性和增加缺氧诱导因子-1α(Hypoxic Inducible Factor，HIF-1α)和基质细胞衍生因子-1α(Sromal-cell Derived Factor，SDF-1α)的生成，从而促进了缺血区的血管生成和增加循环血量[37]。最近国内一项研究发现，褪黑素或高压氧单独治疗均可以改善急性缺血性脑卒中模型大鼠的预后并缩小了梗死面积，并且进一步证实褪黑素和高压氧联合治疗在改善预后方面优于任何一种治疗方式单独治疗[38]。

5.7 联合抗癫痫药物 托吡酯是一种耐受性良好的抗癫痫药物，它通过阻断AMPA/KA受体和发育过程中使用依赖的钠离子通道而起到神经保护作用，已发现在新生儿缺氧缺血性脑损伤中起神经保护作用。褪黑素和托吡酯是两种作用于不同缺氧缺血阶段的药物，无论单独或联合使用，都能显著降低新生儿缺氧缺血模型的梗死面积百分比和凋亡细胞数[39]。

6 总结及前景

综上所述，褪黑素作为一种有效的神经保护剂，在脑缺血性损伤的中起到神经保护作用，通过各种信号转导途径抗氧化应激、减少氧自由基、减少细胞凋亡。它也是参与神经元组织损伤的多个信号通路的多功能调节剂，可促进细胞增殖和神经再生，减轻脑水肿，单独或与其他神经保护药物联合治疗促进脑缺血后神经功能的恢复。目前还没有研究表明褪黑激素具有严重的毒性。以上特点使褪黑素成为一种潜在的治疗脑缺血性损伤的药物。不足之处在于褪黑素对缺血性脑损伤的作用在动物模型上的被证实，但仍缺乏相关的临床研究。希望随着科技和医疗的发展，褪黑素可以逐渐在临床应用上取得肯定的研究，在未来脑血管疾病，尤其在缺血性脑卒中中提供新的治疗靶点，实现其实用价值。此外，褪黑素在缺血性脑卒中中的应用时机及剂量也需要进一步研究。