缺血性脑梗死后免疫机制的研究进展

桂雨农，姜 超，徐中菊

脑卒中是世界范围内威胁人类健康并造成重大经济负担的主要病因，分为缺血性脑梗死和出血性脑梗死，其中缺血性脑梗死占多数[1]。近年来，溶栓已成为治疗缺血性脑梗死的基本方法，由于严格的时间窗限制，该治疗方法不能使所有病人受益[2]。因此，需要寻找一条治疗缺血性脑梗死的有效策略，现从缺血性脑梗死免疫机制出发，结合相关文献资料探索治疗缺血性脑梗死及改善预后的新思路。

1 缺血性脑梗死后引发炎症反应的机制

脑血管阻塞或狭窄引起局部血流不足使得血管壁剪切应力发生改变，氧供不足及活性氧生成共同刺激内皮细胞和白细胞，激活血小板及凝血级联反应，从而快速启动凝血系统，引起微血管阻塞，局部持续缺氧引起一氧化氮生成增多。随着生物利用度降低，使血小板进一步黏附聚集和血管收缩逐渐形成缺血阻塞相互促进的恶性循环，激活的内皮细胞合成分泌内皮素-1、前列环素及多种细胞因子等应激物质，进而高表达E-选择素、P-选择素和细胞间黏附分子1(ICAM-1)，激活的白细胞表达高活性整联蛋白，二者共同介导中性粒细胞和单核细胞等，与内皮黏附、驱动并向梗死部位迁移[3]。在稳态条件下，较少有激活的白细胞穿过血脑屏障，但血脑屏障通透性受到生理和病理波动的影响[4]。急性脑血管损伤后，激活的白细胞产生炎性细胞因子、活性氧、血小板激活因子、蛋白水解酶和白三烯类等，进一步加剧血管收缩和血小板聚集，伴随内皮细胞间紧密连接的严重受损使得血脑屏障通透性增加，这个逐渐恶化的过程最终导致内皮细胞从基底膜脱落，水和自由基进入病人大脑导致出血转化[4-5]。内皮细胞活化导致内皮细胞上血管细胞黏附分子1(VCAM-1)等黏附分子表达，进一步增加白细胞聚集，聚合酶δ-相互作用蛋白2(Poldip2)是内皮屏障功能和炎症反应的关键调节因子，通过相关机制促进脑血管炎症和白细胞聚集[6]。上述变化使脑实质发生局部脑细胞三磷酸腺苷(ATP)供给不足、炎症反应启动、酸中毒、离子稳态失衡、生物能学衰竭、兴奋性毒性物质释放和线粒体功能紊乱等一系列关联事件，导致神经元受损或死亡，从而形成局灶缺血，同时，这些神经元释放损伤相关分子模式(damage-related molecular patterns，DAMPs)激活了免疫细胞表面模式识别受体并产生了促炎因子，导致脑缺血早期炎症环境形成[3]。DAMPs可改变血脑屏障渗透性、白细胞浸润、组织水肿和脑损伤，血脑屏障破坏和之后发生的白细胞外渗加剧了缺血性损伤，DAMPs增强了白细胞外渗，从而在脑缺血区域产生不利影响，因此抑制DAMPs和白细胞浸润是一种有前景的治疗缺血性脑梗死的思路。Poldip2作为内皮功能障碍和白细胞聚集的重要介质，可能成为降低缺血性脑梗死发病率的靶点。相关研究从机制方面证实了黏附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)通路激活是Poldip2介导VCAM-1诱导的一个关键媒介[6]。因此，今后研究应进一步确定Poldip2如何调节FAK通路及抑制Poldip2能否在广泛脑部病变中发挥治疗作用。

2 缺血性脑梗死后中枢神经系统的免疫反应

缺血性脑梗死引起受损脑组织免疫过度激活，不仅是一种内在的器官反应，也是中枢神经系统的固有免疫反应和外周免疫细胞之间相互作用的复杂结果。脑缺血发生后，中枢神经系统抗原与全身免疫接触，导致自身免疫反应激活[7]。炎症小体是一种分子蛋白复合物，作为天然免疫系统的重要组成部分，可将细胞偏离稳态的情况感知为危险信号，之后引发炎症反应。炎症小体中的细胞质内模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)包括核苷酸寡聚化结构域(NOD)样受体热蛋白结构域相关蛋白1(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 1，NLRP1)、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)、NOD样受体家族蛋白4(the NOD-like receptor family CARD domain containing protein 4，NLRC4)或黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)，这些成分可识别炎症介质和DAMPs等。有研究表明，早期NLRP3通过减轻炎症和稳定血脑屏障，保护缺血再灌注损伤，该团队将NLRP3神经元上调确定为缺血再灌注前24 h内早期事件，对应人类脑卒中的超急性期和急性期[8]。故阻断NLRP3可能成为一个新靶点，以限制血管闭塞和再通后再灌注期间炎症驱动的梗死发展。

考虑到脑卒中发生时机体免疫细胞数量有限，中枢神经系统和外周免疫系统在两个区域之间适当分配有限的免疫细胞池，通过向大脑提供足够数量的免疫细胞，维持外周免疫，从而产生必要的脑卒中后炎症反应[9]。外周免疫细胞浸润可能是克服脑缺血损伤的必要反应，在受伤的大脑中引起的神经炎症不可避免地干扰周围免疫[9]。明确中枢神经系统和外周免疫在对抗缺血性损伤的协同作用，可进一步了解缺血性脑梗死的免疫机制。

3 缺血性脑梗死后外周免疫细胞应答

免疫系统受到机体严格调控，过度或不足的激活可能导致过度炎症或感染发生。健康人免疫系统是平衡的，病理状态下，机体免疫系统失衡。缺血性脑梗死发生后免疫反应与受损大脑的炎症反应密切相关，但神经炎症与外周免疫紊乱的相关性尚未明确。

有研究显示，受损的血脑屏障是外周血白细胞侵入脑组织的主要通道，缺血后血脑屏障发生实质改变，随着趋化因子分泌，促使中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等白细胞连续进入缺血组织，其中，中性粒细胞是首先侵入缺血组织的血源性免疫细胞，其次是单核细胞，白细胞增多是脑卒中后炎症反应的标志物[10]。中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)、淋巴细胞与单核细胞比值(LMR)可能是急性缺血性脑梗死的预后标志物。

3.1 中性粒细胞 中性粒细胞是首个被吸引到缺血脑组织的血源性免疫细胞，可生成活性氧、蛋白酶、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9和促炎性趋化因子等，在缺血性脑梗死中血脑屏障破坏、血栓形成和促炎反应发挥着关键作用。中性粒细胞极化与功能异质性有关：通过细胞外刺激，中性粒细胞从神经毒性N1表型向神经保护性N2表型的转变[9]。现阶段观察到的中性粒细胞功能异质性和细胞表型表明，中性粒细胞极化可能成为治疗缺血性脑梗死的一种思路。

3.2 单核细胞与自然杀伤细胞 单核细胞在缺血性脑梗死发生后从血液中移动到炎症组织，这一过程是对伤口愈合和组织修复的重要免疫应答，在局部炎症环境中单核细胞对缓解缺血性脑梗死的临床症状至关重要，蛋白质组学促进了与单核细胞相关的新型生物标志物发展，是评估缺血性脑梗死预后的单核细胞[11]。有研究显示，高水平趋化因子C-C-基元受体2与低水平CX3C基序趋化因子受体1组成的单核细胞亚群(CCR2HighCX3CR1Low)在缺血性脑梗死后不久渗透，之后受特异性细胞因子影响，过度表达CX3CR1，将其转化为高水平CX3C基序趋化因子受体1与低水平趋化因子C-C-基元受体2组成的巨噬细胞亚群(CCR2LowCX3CR1High)，从而衰减缺血性脑梗死的损害[12]。受伤脑组织中CCR2HighCX3CR1Low单核细胞转化可能是抗炎反应的一部分，有助于在缺血性脑梗死后维持微环境稳态，针对单核细胞转化调节可能为脑梗死治疗领域提供一条新思路。

自然杀伤细胞是一种细胞毒性淋巴细胞，在先天免疫中发挥作用。在未启动或处于激活前情况下，自然杀伤细胞可对病理性损伤快速反应，有研究表明，自然杀伤细胞通过增强细胞毒性和炎症加剧脑梗死，提示自然杀伤细胞释放的γ干扰素(IFN-γ)通过招募巨噬细胞或树突状细胞导致缺血损伤[9]。

3.3 T淋巴细胞 缺血性脑梗死是一个多阶段过程，缺血性脑损伤后由于免疫细胞流入脑组织。T淋巴细胞作为重要的免疫细胞，在缺血性脑梗死发病机制中发挥着关键作用，缺血性脑梗死后表现为总T淋巴细胞数量下降，1周内T淋巴细胞数量减少，1～2周，大脑中双阴性T细胞(double-negative T cell，DNT)和CD4+及CD8+T细胞数量逐渐增加，2周后细胞数量逐渐恢复，各亚群比例失调，即CD4+T细胞数量下降，CD8+T细胞数量增加[13-14]。有研究发现，CD8+T细胞最早出现在脑梗死后3 h，而CD4+T细胞最早出现在脑梗死后24 h，其中CD8+T细胞可能与神经元死亡有关，CD4+T细胞可能在组织修复中发挥着作用[15]。CD4+T细胞表面PD-1与Tim-3阳性率可能成为判断急性脑梗死病人预后的临床指标[16]。

脑卒中早期，观察到小鼠脑中DNT数量增加，同时CD200-CD200R1信号通路在急性缺血性脑梗死发展过程受到干扰，CD200R1高表达促进抗炎细胞因子释放，以缓解缺血性损伤；慢性期，白细胞介素(IL)-10+Foxp3+调节性T淋巴细胞从第2周开始增加，脑CD3+CD4+Foxp3+Treg细胞数量在脑卒中后6个月增加，胸腺中CD4+Foxp3+调节性T淋巴细胞(Treg)细胞和脑中IL-10+Foxp3+Treg细胞慢性期逐渐增加，这些表型和数量改变与神经系统严重程度评分(Neurological Severity Score，NSS)相关[13，17]。CD137L-CD137轴通过产生促炎细胞因子促进炎症，有研究通过CD137L-CD137轴对局灶性缺血性脑梗死小鼠模型中炎症组织相关的脑损伤和神经系统缺陷的潜在影响，首次提供了证据，即CD137L-CD137轴通过激活缺血性脑梗死后的炎性信号通路，促进脑损伤和神经功能缺陷，表明CD137L-CD137轴的药理学靶向干预可能有利于限制脑损伤和脑缺血后神经功能缺陷[18]。T淋巴细胞数量恢复和IL-10+Foxp3+Treg增加可能对神经功能长期预后有影响，且急性期和慢性期T淋巴细胞动态变化可能在发病和恢复中发挥着不同的作用。为探讨T淋巴细胞的动态变化，Minha Ki团队[13]分析第1天至第6个月淋巴器官和大脑中T淋巴细胞，结果显示，CD4+CD62L-效应T淋巴细胞在血液中比例升高，脾脏中比例降低，进一步观察到tMCAO小鼠大脑中效应T淋巴细胞水平增加。表明脑卒中早期，效应性T淋巴细胞从脾脏流出，通过血液进入大脑损伤部位，幼稚的T细胞可能留在脾脏。

T淋巴细胞在脑卒中后脑损伤部位有不同的浸润时间，取决于促炎或抗炎功能。相关研究表明，活化的T淋巴细胞在缺血性脑梗死早期发挥着有害的作用，Tregs作为具有潜在神经保护作用的内源性调节剂，在血脑屏障渗透性、白细胞浸润、组织水肿和脑损伤中发挥着保护作用，并对预后康复起重要作用[13，15，19]。区别于T淋巴细胞，B淋巴细胞在脑卒中的作用已被阐明，缺乏成熟B淋巴细胞的小鼠中观察到较大的缺血损伤和较高的死亡率，通过移植B淋巴细胞可改善小鼠预后，表明B淋巴细胞在脑卒中的有益作用[9]。脑卒中后T淋巴细胞长期变化尚未明确，深入研究T淋巴细胞在缺血性脑梗死不同时期的动态变化可能有助于明确潜在的治疗靶点。

3.4 LMR与NLR 中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞与脑梗死的严重程度及预后恢复有关，但联合多个炎症标志物LMR和NLR的研究尚未明确。有研究回顾性分析339例急性缺血性脑梗死病人的临床资料，结果显示，急性缺血性脑梗死病人脑缺血损伤后，淋巴细胞计数减少，单核细胞计数增加，该变化可能与脑梗死后免疫抑制相关，而LMR与病人短期预后有关，较高的LMR常提示较好的临床结局[20]。除LMR外，NLR>3.5可有效预测脑梗死不利结局[21]。将中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞整合成LMR、NLR等新指标，不仅可较好地反映脑梗死后免疫状态，同时也是一项预测急性缺血性脑梗死严重程度、预后恢复的指标。

4 肠道菌群的免疫机制

肠道菌群与较多的脑梗死危险因素直接相关，包括高血压、糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、血管功能障碍等[22]。急性脑缺血同时可诱发局部神经炎症反应，改变外周免疫稳态，导致肠道菌群结构改变。大面积脑缺血病灶导致肠道菌群失调，脑梗死后小鼠肠道菌群多样性减少，拟杆菌过度生长表明脑梗死后菌群失调[23]。从免疫机制角度分析，肠道微生物群和代谢物可能影响脑梗死恢复，有研究显示，缺血性脑梗死导致肠道失调使得肠道上皮完整性受损，周围皮质神经炎症，从而引起结肠炎症反应、肠道屏障受损、内毒素血症增加及局灶性炎症激活[24]。肠道微生物群和代谢物可直接调节来自肠道的免疫细胞，之后迁移到缺血脑组织并参与神经损伤和修复过程，同时在调节肠道屏障渗透性方面发挥着关键作用，进一步通过影响微生物群或外周循环中的代谢物引发免疫应答，肠道菌群可改变胶质细胞在中枢神经系统中反应，可能具有神经元修复调节功能[25]。随着肠道微生物菌群和脑梗死相关性研究领域的进一步深入，可能从免疫机制角度切入缺血性脑梗死后肠道疾病的治疗。

5 免疫机制在治疗缺血性脑梗死的应用

虽然静脉溶栓和血管内介入治疗已证实是有效的治疗缺血性脑梗死的方法，由于严格的治疗适应证和时间窗限制，仅有少数病人有条件接受溶栓治疗。治疗脑卒中核心症状，尤其是脑卒中后急性脑损伤方法有限，故有必要寻找一条新思路应用于大量临床病人。

阿托伐他汀是一种在缺血性脑梗死治疗中具有抗炎作用的药物，而肠道微生物群在缺血性脑梗死发病机制中发挥着重要的作用。有研究显示，阿托伐他汀通过抑制永久性大脑中动脉闭塞(pMCAO)小鼠梗死周围皮质小胶质细胞促炎极化，显著改善感觉运动行为缺陷，并减轻了小胶质细胞介导的神经炎症[24]。阿托伐他汀逆转了微生物组成，如增加厚壁菌和乳酸菌丰度，降低拟杆菌丰度，从而提高了粪便丁酸水平，促进了肠道屏障功能，同时，阿托伐他汀可调节肠道免疫功能，如单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotac ticprotein-1，MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、循环内毒素(脂多糖结合蛋白)降低，IL-10升高。从阿托伐他汀治疗的小鼠中收集的粪便微生物群，通过移植可有效减轻pMCAO小鼠神经炎症，且粪便微生物群移植的抗炎作用与口服阿托伐他汀相似[24]。上述研究结果提示，阿托伐他汀通过微生物组成和肠道屏障功能发挥抗炎作用，可改善神经行为缺陷，减小梗死体积，抑制小胶质细胞促炎极化，同时调节肠道微生物，抑制结肠促炎细胞因子产生，增加肠道紧密连接蛋白表达。通过介导肠道菌群恢复，改善肠道屏障功能，调节肠道免疫功能，共同参与脑梗死小鼠抗炎过程。

牡荆苷作为一种从牡荆叶和牡荆子中提取的黄酮类化合物，对急性脑缺血大鼠具有抗氧化应激活性和脑保护作用。相关研究表明，牡荆苷可改善急性脑缺血大鼠神经行为学，减小脑梗死体积，降低缺血性神经元细胞凋亡率，且剂量越高作用越佳，推测与减少到达大脑纹状皮质组织神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)免疫阳性神经元数量、抑制免疫表达、下调mRNA和蛋白表达有关[26]。为缺血性脑梗死病人的研究提供了治疗新方向。

丁苯酞临床可治疗轻中度急性缺血性脑梗死，具有抗神经细胞凋亡作用，但其对炎症反应影响的研究机制尚未明确。有研究观察丁苯酞对缺血性脑梗死大鼠脑组织的影响证实其对缺血性脑梗死有保护作用，结果显示，作用机制与抑制脑组织核因子激活的B细胞的κ-轻链增强(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65活化，脑组织炎性因子IL-6、TNF-α水平降低有关[27]。

免疫反应是一种高度调节的防御系统，免疫检查点作为一条配体-受体相互作用触发的刺激或抑制信号通路，可调节组织和病原体特异性反应，在癌症、感染和自身免疫疾病中发挥着关键作用[4]。脑血管疾病的神经炎症与不良神经功能有关，免疫失活检查点调节剂可能是治疗脑血管疾病急性、慢性神经炎的策略，可减少免疫细胞聚集、细胞因子分泌及脑水肿和神经退行性变。抑制性检查点如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)和淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)是维持自身耐受并限制免疫反应持续时间和强度的负性调节因子；OX40(CD134)和401BB等阳性调节因子具有协同刺激功能，其他检查点，如T细胞免疫球蛋白和黏蛋白域-3(Tim-3)具有刺激和抑制调节功能[4]。因此，根据不同免疫细胞群中的表达和影响模式及炎症级联过程中的活动时间，每个检查点可能具有独特的调控特征，基于检查点的免疫治疗具有巨大的临床潜力。

有研究表明，急性脑梗死病人血清IL-6水平升高，且病人发病6 h内脑脊液IL-6水平与24 h脑梗死体积呈正相关，提示IL-6参与损伤早期的急性炎症反应，缺血性脑损伤后应用IL-6中和抗体可显著减小脑梗死体积，减轻急性期脑组织炎性反应，抑制急性炎性细胞对脑组织的浸润，从而改善脑梗死发生后28 d神经功能，提示IL-6中和抗体处理可能成为治疗脑缺血损伤的有效方法[28]。缺血性脑梗死发生后，神经血管单元(neurovascular unit，NVU)炎症和外周血白细胞浸润是导致脑损伤扩大的主要因素。全脑和局灶性脑缺血模型中，应用最广泛的CDKs抑制剂(R)-活性氧covitine及其(S)异构体均可减少脑损伤。S-活性氧covitine通过调节缺血时NVU反应发挥作用，一些炎症模型中，活性氧covitine可减轻白细胞介导的炎症反应，主要靶向抑制cdk1、cdk2、cdk5、cdk7和cdk9的特异性，表明这些CDKs在缺血性脑梗死后NVU细胞和白细胞的炎症过程中发挥着关键作用[29]。有研究显示，R/S-活性氧covitine在几种缺血性脑卒中模型中显示出有益的作用：(S)-活性氧covitine可减轻脑水肿和减小梗死体积，与减少神经元死亡、保护血脑屏障和内皮、促进小胶质细胞增殖和星形胶质细胞反应性有关。有研究表明，(R)-活性氧covitine可作用于其他NVU细胞及非缺血状态时的白细胞[29]。上述研究提供了(S)-活性氧covitine和特异性CDKs抑制剂作为缺血性脑梗死潜在治疗药物的可能性。

粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)作为中枢神经系统的一种内源性配体，具有抗凋亡、免疫调节、促进神经发生和血管生成等多种重要功能。G-CSF治疗通过减少促凋亡蛋白，增加抗凋亡蛋白，发挥对受损神经元的神经保护作用，既减少了急性神经元变性，同时增加了脑缺血后的长期可塑性[15]。有研究显示，CB2受体激动剂可治疗缺血性脑梗死，而CD16+单核细胞中CB2受体表达升高与缺血性脑梗死病人脑梗死严重程度相关，可能作为缺血性脑梗死的潜在药理学靶点[30]。

缺血性脑梗死破坏了大脑免疫系统静止状态的平衡。炎症在扩大缺血性中枢神经系统神经元损伤中发挥着重要的作用，虽然抗炎策略可减轻神经炎症，同时应考虑其对周围免疫的影响。调节外周免疫的其他策略包括远程缺血条件反射，通过改变免疫细胞组成可实现器官之间的交叉耐受及脑卒中后干细胞治疗等[9]。预防性抗生素和益生菌治疗可能是免疫调节的新策略，可减轻周围感染和调节肠道微生物群，最终影响脑卒中病理生理过程[5]。若结合溶栓术，免疫调节可最大限度减轻缺血性损伤和免疫缺陷，从而防止全身感染，提高缺血性脑梗死后生存率和长期预后，今后需开展大规模、设计合理、方法规范的临床试验。

6 小结与展望

综上所述，免疫反应和炎症是缺血性脑梗死病程中的关键因素，免疫系统是一把“双刃剑”，虽然在某些环节对缺血脑组织发挥着保护作用，并提供了一些治疗新选择，同时引起一些严重的副作用，因此，分析缺血性脑梗死和免疫机制之间的关系是必要的。充分了解炎症反应在缺血性脑梗死中的具体作用和机制可能为探索新疗法提供选择。进一步确保促炎因子和抗炎因子之间的动态平衡，有助于较好地预测发病后一些非血管并发症，其中重要的并发症是脑卒中后感染，脑卒中后感染导致病人死亡率增加及预后不良[7]。缺血性脑梗死免疫学发病机制的深入分析有助于病人获得较好的临床结局和康复效果。有研究通过探讨啮齿动物研究脑卒中后炎症反应，对人类和啮齿动物缺血后神经炎症进行系统分析和比较，结果显示，啮齿动物脑卒中模型炎症反应与脑卒中病人相似[31]。肠道菌群微生物领域中，需深入研究特定的微生物群在脑卒中和免疫反应中的相互作用，以区分和明确缺血性脑梗死中的神经保护或有害细菌种类，肠道微生物菌群可能是解决脑梗死及改善预后的重要靶点。

将中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞整合成的LMR、NLR等新指标，不仅可较好地反映缺血性脑梗死后的免疫状态，同时可作为预测急性缺血性脑梗死严重程度、预后恢复的相对简便、经济的指标。针对多种传统治疗缺血性脑梗死药物的研究提示，免疫反应在疾病发生发展和药物起效过程中发挥着重要的作用，今后需进行大规模临床研究探讨具体作用机制，进一步探讨缺血性脑梗死后免疫机制，有望发掘出新的治疗方法。