核酸检测技术在血液病毒筛查中的应用进展

祝文坚

（梧州市中心血站，广西梧州，543000）

经血液传播疾病中，常见为乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及人类免疫缺陷病毒（HIV）。为保证血站血液安全性，各国采血机构严格开展病毒抗原、抗体检测，以阻断输血相关传染性疾病传播[1]。目前我国原卫生部规定血液筛查中常见标准方法为血清学酶联免疫吸附试验（ELISA），但ELISA技术实施过程中，往往会存在固有缺陷，对血液整体筛查安全性造成影响，存在血清学检测技术存在“窗口期”、病毒变异及免疫沉默等，引起漏诊[2]。而针对常见三类病毒基于ELISA 检测试剂条件下平均“窗口期”分别为：乙型肝炎表面抗原（HBsAg）59d、丙型肝炎病毒抗体（抗-HCV）72d、人类免疫缺陷病毒抗体（抗-HIV）22d，上述漏检下，检测不到病毒但具备感染性，导致血液质量存在隐患[3]。核酸扩增技术（NAT）可有效缩短病毒“窗口期”，并逐渐成为发达国家及部分发展中国家献血者常规筛查技术[4]。随着NAT 技术被广泛用于血液筛查中，其优势取得广大医疗工作者认同。文章就对核酸检测技术在血液病毒筛查应用情况如下分析，现报道如下。

1.血液病毒筛查核酸检测技术概括

荧光-PCR 法对DNA 复制过程模拟，PCR 反应体系中，荧光染料在特异性掺入到DNA 复制成双链中，发挥荧光信号，对未掺入DNA 双链的荧光染料，则不会发射荧光信号，实施检测荧光信号后，实现对核酸扩增实时监测[5]。核酸扩增（Transcription-mediated Amplification，TMA）将化学发光基团标记至寡核苷酸引物，并模拟DNA 转录至RNA 过程，寡核苷酸探针价到扩增后RNA 产物后，依据化学发光检测靶病毒核酸。与荧光PCR 法比较，TMA 法仅在病毒核酸扩增反应后，并完成对核酸检测。当病毒感染数天后，通过核酸检测病原体核酸，进一步缩短检测“窗口期”。研究指出[6]，依据核酸检测试剂，可缩短病毒检出“窗口期”。研究指出[7]，核酸检测与酶联免疫检测联合应用，显著提升病毒检出率，而降低传染性病毒感染漏诊率、误诊率，且采取血清学试剂，无法对病毒突变株、隐匿性病毒感染加以检测，经核酸检测可有效补充。

2.NAT 应用于血液筛查效果

2.1 PCRPCR 技术经设计引物或探针，对目标致病菌特异性DNA或RNA 序列监测。PCR 检测技术包括以下几类：PCR 技术、mPCR、qPCR 等。PCR 技术特点为准确性高、敏感性高，目前被用于食源性致病菌检测中[8]。实时荧光定量PCR 反应中，引入荧光化学物质，伴随着PCR 反应进行，PCR 反应产物累计，可增加荧光信号强度等比例。依据荧光强度变化，并对产物量变化检测，获得一条荧光扩增曲线，当荧光信号出现，则本底进入指数增长阶段拐点，可达到荧光阈值为阳性，反之为阴性，上述技术开展中，定量分析DNA、RNA 样品量[9]。荧光定量PCR 法作为常见一类分子生物学检测方式，选择HCV 基因高度保守区一段编码区为靶区域，设计特异性引物、探针，进一步RT-PCR 扩增，用于血清或血浆样本中HCV-RNA 定量检测。检测HCV-RNA 阳性及其病毒量多少，可证明存在HCV，且提示复制活跃程度及传染性强弱。研究指出[10]，荧光定量PCR 相比较化学发光试验，二者均会产生假阳性，但PCR 检测结果假阳性率低于化学发光试验。目前PCR 检测技术受到国内外医学界广泛认可，但无法有效控制感染假阳性情况发生，使得临床应用受限。

2.2 等温扩增技术等温扩增技术特点为经济效益较低，对技术人员要求偏低且方便快捷。对其原理分析得出，依据致病菌或病毒保守序列设计精细引物-探针组，在恒温下对目的基因片段进行特异性快速检测[11]。环介导扩增技术为2000年问世一项等温扩增新技术，针对靶基因设计4 个特异引物，利用链置换DNA 聚合酶，在恒温60～65℃，60min 内完成扩增，灵敏度高，且对设备要求偏低。等温扩增技术操作中通过捕获目标并选择洗涤剂，破坏病毒包膜及衣壳，RNA 或DNA 释放，捕获寡核苷酸结合于病毒核酸，结合于磁性微粒的互补序列[12]。促使MMLV逆转录酶和T7 RNA 聚合酶扩增，并产生有目标序列DNA 拷贝，以此为模板并对HIV-RNA、HCV-RNA、HBV-DNA 区域扩增，第三步对标记有化学发光分子检测探针，探针试剂中含有两种不同吖啶酯分析，一种为标记在内标记特异性探针闪光发光分子Ortho firoro-AE，另一种为病毒特异性探针的辉光发光分子1-methyl-AE。上述两种AE 分子具有不同发光特性。基于闪光型分子在发光试剂作用下并发出强烈光，延续时间较短，且光强度下降加快，辉光性分子基于发光试剂作用下，缓慢发出一定强度光，且持续时间较长[13]。利用化学发光检测仪对样本管中发光状况连续检测，描绘强度曲线并处理数据，判断内标结构是否存在病毒核酸。特异性强，灵敏度高，反应条件简单，扩增效果高。

3.国内外血液筛查核酸检测应用现状

3.1 国外英国《大出血患者血液管理实用指南》中提到核酸检测应用，且目前多数国家实行HIV RNA 筛查。当感染HIV 后，HIV RNA 首先出现在血循环标志物中，依据HIV RNA 到检出HIV P24 抗原之间窗口期缩短，HIV RNA 筛查价值与使用血清学筛查试验、献血者HIV 感染发生率关系密切[14]。因此，WHO 建议综合评价HIV RNA 筛查所能提高血液安全程度。早在20 世纪九十年代国外开始应用核酸检测技术，日本为最早应用过程，自1997年，得到和荷兰等国家在全部血站推广核酸检测筛查，自1999年美国同样将核酸检测纳入到常规血源筛查。

3.2 国内为进一步保证国内输血安全性，从2000年3月我国在12 个省市15 个血液中心开展核酸检测试点工作，并发现采取核酸检测后，可提升血液安全性。自2002年我国并将核酸检测技术应用于HBV 表面抗原阴性、抗HIV 阴性及抗HCV 阴性原料血浆筛查研究工作。2012年10月，国务院发布《卫生事业发展“十二五”规划》要求至2015年底，将血液筛查核酸检测基本覆盖全国。并在2015年2月13日原国家卫生和计划生育委员会、财政部办公厅联合发出《关于做好血站核酸工作的通知》，要求各地按照《卫生事业发展“十二五”规划》等要求推进血站核酸检测工作，进一步保证血液安全，前期充分总结核酸检测试点工作经验，依据实际情况狠抓落实，保证核酸检测工作覆盖全国[15]。近十多年来，国内一些血液制品生产企业及多数采供血机构均开展病原体核酸检测，包括北京、深圳及上海等。

4.小结

目前血液筛查核酸试剂完全商品化，操作简便及自动化，目前全世界关注焦点问题为如何提高血液安全性，目前国内将NAT 作为常规检测并应用于血液筛查中，从以往对比研究得出，血液病毒筛查血清学方法与核酸检测方法结果为互补的，应当将上述两种方法联合应用，进一步加大对血液筛查力度，保证血液应用安全性。依据我国国情并建立血液传染病指标筛查新模式，进而保证血液安全。