骨肉瘤化疗多药耐药现象及中药抗耐药研究❋

潘 雪， 石倩玮

(1.中国中医科学院广安门医院， 北京 100053；2.中国中医科学院博士后科研流动站， 北京 100700)

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，该肿瘤被界定为存在产生类骨质和/或未成熟骨的恶性间充质细胞。全球范围内，骨肉瘤的患病率为4.3%，且呈双峰年龄分布，于15～19岁儿童及青少年人群中达到高峰，而第二个高峰则出现在年龄≥75岁的老年人群中[1]。从监测、流行病学和最终结果(surveillance, epidemiology and end results，SEER)数据库中提取数据显示，在过去的10年中，经过年龄调整后，每年骨肉瘤新发病例以0.4%的速度增长[2]。骨肉瘤最常见的症状是骨痛，随着病情的进展，可逐渐出现局部肿胀、肿块及关节活动受限情况，对于确诊时已转移或复发的患者，其5年生存率往往低于30%[3]，严重影响患者的身心健康，并降低生活质量。

目前，新辅助化疗对于骨肉瘤的治疗具有重要意义。但患者在长期化疗后，易出现多药耐药(multidrug resistance，MDR)，影响化疗效果。因此，为解决骨肉瘤化疗的MDR问题，针对相关耐药机制进行新药开发、制定靶向治疗策略成为骨肉瘤治疗的新方向，而中医药具有多靶点、低毒、高效等治疗优势，在逆转骨肉瘤化疗的多药耐药现象方面发挥着重要作用。

1 MDR已成为新辅助化疗治疗骨肉瘤困局

上世纪70年代前，针对骨肉瘤的治疗方法有限，疗效欠佳。70年代后有研究报道，应用大剂量甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂能够有效治疗骨肉瘤[4]，随后将其应用于骨肉瘤的临床治疗中，使得该病的无病生存率接近70%。因骨肉瘤的治疗取得阶段性进展，辅助化疗的临床疗效被国内外学者肯定。随着外科技术的发展，如何改善骨肉瘤患者生存率，提高保肢率逐渐受到重视。1979年Rosen等对“新辅助化疗”概念的提出，进一步完善改进了原有的辅助化疗，强调了术前化疗，即术前化疗-手术-术后化疗，包括T4/T5方案，成为最早制定治疗骨肉瘤的可行模式。新辅助化疗在提高保肢率、降低控制转移方面发挥了重要作用，且联合化疗干预骨肉瘤可使其5年生存率由不及20%提高至65%～70%[5]，因此该疗法已成为目前骨肉瘤的首选及标准治疗模式。

随着现代医学的发展，绝大多数学者认为化疗是提高骨肉瘤患者远期生存率的主要手段，阿霉素、甲氨蝶呤、顺铂及异环磷酰胺是公认的治疗骨肉瘤有效化疗药物，且在药物剂量的认知上亦达成共识。尽管在骨肉瘤化疗方案上尚未形成定论，但多年来通过临床工作者的不断研究和探索，已证实新辅助化疗能为患者带来一定的益处，并被广泛应用于临床治疗中。虽然该疗法能在一定程度上延缓骨肉瘤患者的生存期，但不断提高的化疗强度已经接近人体耐受极限，即使增大药量、增加联合化疗药物种类或改变给药途径，仍然有20%～30%的病例收效甚微，MDR即是治疗的一大挑战。目前普遍认为，MDR是肿瘤细胞对化疗药物杀伤作用最重要的抵御与自我保护机制，由一种药物诱发产生耐药性的同时，对其他抗肿瘤药物也产生药物对抗反应，是恶性肿瘤化疗失败和复发的重要原因，导致骨肉瘤患者的生存状况难以得到改善[6-8]。

2 骨肉瘤化疗的MDR发生机制

自从1970年Biedle等首次发现MDR以来，国内外学者进行了广泛、深入的基础实验与临床研究，探寻MDR产生的分子机制取得了一定的进展。目前，在涉及MDR的病理机制中，多项研究聚焦于肿瘤细胞对药物的摄取减少及外泵增加方面，ATP结合盒(atp-binding cassette，ABC)转运蛋白超家族的参与和MDR形成具有密切关联[9]。

P-糖蛋白(p-glyeoprotein, P-gp)是其中被研究最早、最深入的ABC转运蛋白超家族成员。P-gp是一种分子量170 kD的跨膜糖蛋白，由位于人类染色体7q21.1的ABCBI(MDR1)基因编码，它具有“药泵功能”，其跨膜区域可结合药物，2个ATP结合域相互靠近与ATP结合释放能量，促使中心孔道开放，将药物转运至细胞外使浓度下降，最终导致化疗耐药，这是产生MDR的经典途径[10-12]。多项研究[13-15]表明，P-gp的高表达是骨肉瘤产生MDR现象的关键机制，也是影响患者预后的重要因素，较高的复发率及转移率与其相关。

除了P-gp介导的MDR经典途径以外，多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)介导的化疗药物外排也是产生MDR的另一条重要途径。MRP与P-gp具有诸多相似之处，亦属于ABC转运蛋白超家族成员，是第一个被发现的ABCC亚家族转运蛋白。MRP蛋白在体内主要分布于细胞质内的质膜系统，具有解毒防御、分泌作用，可介导细胞膜及细胞质囊泡内部的物质转运，调整细胞内物质分布，目前已发现9种具有转运功能的MRP，分别为MRP1-MRP9[16]。MRP可以转运砷等重金属，保护机体免受环境中氧化态重金属阴离子的伤害。MRP1是该家族中研究最为透彻的一个蛋白。有研究发现，肿瘤细胞膜上大量表达MRP1，MRP1可转运蒽环霉素和长春花生物碱等抗癌药物，通过识别化疗药物与谷胱甘肽(glutathione，GSH)形成的共轭物，将其排出细胞外，从而导致耐药[17]。MRP1介导的药泵功能和经典的P-gp介导耐药机制有部分相同底物，二者不同之处在于MRP1介导的药物转运外排途径是伴有GSH的共轭转运而进行的。基于现有的研究报道，P-gp及MRP1过表达被认为是肿瘤MDR最主要的因素。屠重棋等[18]研究对正常成年骨组织及骨肉瘤组织进行免疫组化检测对比分析，结果证实71.11%骨肉瘤组织中MRP1表达呈阳性，且MRP的表达与该肿瘤恶性程度呈正相关。

随着研究的深入，众多学者发现骨肉瘤化疗的MDR并不是通过单一途径介导发生，可能是多种机制相互作用的结果。针对化疗药物的解毒作用，目前研究较深入的是谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)。有学者认为，GSTP1的过度表达与多种恶性肿瘤的化学抵抗及预后有关。一项以60例30岁以下患者骨肉瘤标本为对象的研究表明，GSTP1过表达与术前化疗的组织学不良反应有密切关联[19]。另外，细胞凋亡也是化疗诱导细胞死亡的重要方式，细胞周期停滞及凋亡的一系列相关基因表达均可参与化疗细胞毒性的调节，如p53、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)基因等[20，21]。由此可见，细胞解毒、细胞凋亡抑制与肿瘤细胞的耐药有关。近年来，关于DNA损伤修复机制、骨肉瘤干细胞、细胞自噬作用的研究亦在不断开展，但仍有很多耐药因素尚未被阐释明晰，需要进一步探索。

3 骨肉瘤化疗耐药逆转策略

现阶段，如何逆转MDR、提高骨肉瘤化疗效果已成为一项世界性难题。通过对肿瘤MDR产生的分子机制进行研究，已经明确一些关键蛋白及异常生物过程调控在MDR中发挥着重要作用，并基于此开发了相关蛋白分子抑制剂，以尝试逆转肿瘤化疗耐受。

其中，P-gp抑制剂能通过抑制细胞中P-gp转运活性发挥MDR逆转作用，临床中常应用钙离子通道抑制剂维拉帕米和环孢霉素A及其衍生物，但由于其毒副作用巨大，干扰化疗药物的药代动力学，使得MDR逆转剂的临床应用受到限制。另外，针对MRP1介导肿瘤细胞MDR逆转剂的研究方向主要包括两方面，一是针对MRP1介导药物中GSH的共轭物外排转运特点，通过抑制GST/GSH系统，耗竭细胞内GSH，从而减少MRP1对化疗药物的外排转运，如丁硫氨酸硫酸亚胺(buthionine sulfoximine，BSO)；二是针对MRP1转运底物的结构特点而合成的化合物,如以异恶唑为基础的化合物LY40291、喹啉化合物MS-209、LY335979等[22]。目前这些MRP1逆转剂尚处于体外实验阶段，属于前期研究阶段，是否对人体有效还需要进一步的临床验证。

纵观现有可行的MDR逆转方法，或因造成明显不良反应，或因价格昂贵、技术难度高，或因缺乏进一步临床循证数据支撑，使MDR的临床干预受限。因此，探讨MDR产生机制的同时，仍需不断寻求安全、有效的化疗耐药逆转方法。

4 中药在逆转骨肉瘤耐药中的应用前景

近年来，中药已成为抗肿瘤研究的热点问题，中药资源丰富，能够通过多途径、多靶点发挥疗效，在肿瘤治疗中的重要性不断提高。针对肿瘤MDR机制的复杂性，中药是有潜力开发成为能够逆转耐药的理想药物，其天然产物活性成分能够影响肿瘤MDR，受到肿瘤届医学同道的广泛关注[23]。这些潜在的治疗药物或具有钙通道阻滞作用，或影响与耐药相关蛋白的表达，或通过调节细胞凋亡等方式发挥逆转MDR的作用。

4.1 粉防己碱

粉防己碱又名汉防己甲素，是一种双苄基异喹啉类生物碱，主要来源于中药防己根。粉防己碱具有广泛的药理作用，包括抗肿瘤活性，具有钙通道阻滞作用。王进等[24]研究发现，粉防己碱对骨肉瘤耐药细胞系U2OS/DOX具有逆转作用且其疗效优于维拉帕米及环孢霉素A。Lu等[25]通过评估粉防己碱对骨肉瘤中MDR的预防作用也得到了类似结论，结果表明粉防己碱能通过抑制P-gp过度表达，进而预防紫杉醇引起的MDR，这种变化机制可能与抑制骨肉瘤中的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号传导有关。

4.2 姜黄素

姜黄素是姜黄根茎植物中重要的成分之一，具有良好的抗炎及抗癌特性，能够起到逆转MDR的作用。有研究[26]表明，姜黄素能增加阿霉素对阿霉素抗性骨肉瘤细胞株U2OS/ADM的毒性作用，且呈剂量依赖关系，可有效逆转U2OS/ADM细胞的MDR现象。Si等[27]通过体内外两方面实验证实，姜黄素具有增强抗肿瘤药物活性、抑制多药耐药细胞增殖、侵袭及转移作用，其下调P-gp且抑制P-gp外排泵功能可能有助于MDR逆转。

4.3 三七皂苷R1

三七总皂苷是三七的主要活性成分，其特征化合物即为三七皂苷R1，该化合物对多种器官、组织具有良好的调节作用，而且已被证实在癌症中能够发挥抗肿瘤作用[28]。在骨肉瘤的研究中，三七皂苷R1能够剂量依赖性地削减骨肉瘤细胞活力及迁移能力，并诱导肿瘤细胞凋亡。Lu等[29]通过研究也发现，三七皂苷R1能够抑制骨肉瘤细胞中的阿霉素抗性。从机制上分析，其能够有效阻断白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)诱发的Janus激酶2(janus kinase 2，JAK2)/信号传导及转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路的激活，临床应用前景广阔。

4.4 槲皮素

槲皮素是一种常见的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抑制癌细胞增殖作用，并能够诱导其凋亡[30]。已有研究报道[31-33]，槲皮素在多种恶性肿瘤中作为辅助药物能增强化疗药物的治疗效果，具有较大的开发潜力。Zhang等[34]研究对槲皮素联合顺铂治疗骨肉瘤的效果进行评价，结果证实槲皮素能够通过调节miR-217-KRAS，增强顺铂治疗骨肉瘤的敏感性，值得进一步研究。

4.5 雷公藤甲素

雷公藤甲素(triptolide, TP)来源于中药雷公藤，其生物活性强，具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤等多种药理作用[35]。在抗肿瘤方面，TP能够抑制多种肿瘤细胞生长并诱导其发生凋亡或者自噬，抑制血管生成，减少远端转移[36]。在TP抗骨肉瘤效应方面，有文献报道[37]TP作为丝裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)的抑制剂，能够阻止MKP-1的表达，增强顺铂诱导的骨肉瘤细胞死亡，表明TP与顺铂能够协同抑制骨肉瘤细胞增殖。这些研究结果提示，TP具有逆转骨肉瘤化疗MDR的潜能，能够与化疗药物协同发挥抗肿瘤效应。

5 总结与展望

中药具有多成分、多途径、多靶点的特点，治疗肿瘤历史源远流长且毒性小，在逆转骨肉瘤MDR方面已展现出治疗优势及潜力，但仍存在一定的局限性。纵观现有的研究报道，大多体外实验具有一定的局限性，针对中药单体的药理作用及机制还有待进一步通过体内实验验证；目前，中药复方干预骨肉瘤的防治研究相对较少，中医历来重视整体观及辨证论治，因此复方的应用有着广阔的发展前景。在今后的研究中，可进行相关研究探讨中药复方能否通过多药味的协同作用，增强机体的抗癌能力，提高化疗敏感性，进而逆转MDR。以上问题的进一步完善，将为拓展临床应用提供科学依据，对开发切实有效的新药具有重要价值；近年来，已有多种检测新技术涌现，对疾病的预防、诊断及预后意义深远。因此，亟需对中药MDR逆转剂处理或未处理的化疗耐受肿瘤细胞进行整体的蛋白质和基因组定量分析，探求经中药处理后细胞内蛋白及基因表达差异，并通过生物信息学技术分析这些差异蛋白或基因所在的信号网络，为进一步阐释中药基于多靶点、多阶段性特性逆转骨肉瘤化疗MDR的分子机制，提供方向及切入点。