武夷菌素防治大豆菌核病的作用机制

杨淼泠，谢家贝，鲁妍璇,2，施李鸣，张克诚，葛蓓孛*

（1. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；2. 河北农业大学林学院，保定 071000）

关 键 字：武夷菌素；大豆；核盘菌；抑菌机制；诱导抗性

1 农用抗生素的概况

农用抗生素是指由微生物产生的，可用于抑制或杀灭农作物病、虫、草害或调节作物生长发育的微生物次级代谢产物[1]。因具有毒性低、易降解、选择性强、对环境安全、不易产生抗药性等优点，成为被广泛应用的生物防治产品之一[2]。自20世纪50年代以来，我国相继研制出多种具有我国自主知识产权的农用抗生素，按作用功能可分为杀菌抗生素、杀虫抗生素、除草抗生素和植物生长调节剂。

随着用于植物病害防治的农用抗生素产品不断增加，其防病作用机制也成为了研究热点。目前，已报道的农用抗生素可直接利用拮抗机制杀死或抑制病原菌，通过作用于病原菌的细胞壁，使菌体细胞膨胀、变形，破坏病原菌形态结构；或是通过增强病原菌细胞膜的通透性，使胞内物质外泄，导致菌体死亡；或是干扰病原菌蛋白质和核酸合成以及能量代谢等生理生化过程，起到抑制和杀死病原菌的作用[3,4]。此外，农用抗生素还可以通过与寄主植物互作，影响植株体内的信号传导或相关防御反应，提高植物的防御能力[1]。

2 武夷菌素对大豆菌核病的防治效果

武夷菌素是由小白链霉菌武夷变种Streptomyces albulusvar.wuyiensis代谢产生的一种高效、低毒的农用抗生素[5]，可用于防治多种农作物真菌性病害，对白粉病、灰霉病、白腐病、黑星病、菌核病、霜霉病、枯萎病等均具有很高的防效，同时还具有一定的增产作用[6,7]。1998年开始产业化生产并得到大面积推广应用[8]。前期平板抑菌试验结果表明，武夷菌素对核盘菌菌丝生长具有显著的抑制效果，EC50为5.13 µg/mL[9]。离体叶片接种表明，200 mg/L武夷菌素防治大豆菌核病的效果为78.4%，显著高于200 µg/mL中生菌素的防效69.4%[9]。大豆盆栽试验表明，经50 µg/mL武夷菌素预防性喷施后对大豆菌核病的防效达62.56%。在田间人工模拟菌核病发病的情况下，2%武夷菌素（100倍液）分别于大豆封垄期、开花初期和开花盛期连续喷施3次，防治效果为64.0%[10]。以上结果均说明武夷菌素对大豆菌核病具有良好的防治效果，可作为防治大豆菌核病的生防制剂进行应用。因此，全面了解武夷菌素对核盘菌的防病机制，可以为在大豆生产上科学使用武夷菌素提供理论依据和技术指导。

3 武夷菌素抑制核盘菌的作用机制

3.1 影响核盘菌的生长发育

细胞膜是细胞的一种重要的生物屏障。农用抗生素可以通过作用于菌体细胞膜，破坏其屏障功能，造成细胞内物质外泄，起到抑制和杀死病原菌的效果。通过碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染色法，测定武夷菌素对核盘菌细胞膜通透性及胞内核酸和蛋白质泄露的影响[11]。研究表明，武夷菌素能增大核盘菌细胞膜通透性，其处理后，PI能穿过破损的细胞膜进入细胞，并与DNA结合，在荧光显微镜下能清晰地观察到充满红色荧光的菌丝[9]。同时，武夷菌素处理组在260和280 nm下吸光度值显著高于对照，证明武夷菌素能引起核盘菌胞内蛋白质和核酸外泄，起到杀死病菌的作用[9]。

植物病原菌的正常菌体形态是维持其生长发育及内部生理代谢稳定有序的重要因素。通过光学显微镜观察发现，武夷菌素处理的核盘菌，菌丝稀疏，菌丝量减少，且菌丝顶端分支减少[9]。菌核作为核盘菌长期生存在土壤中的主要结构，具有巨大的生殖潜力和长期生存能力。当条件适宜时，菌核通过萌发产生子囊盘或菌丝，启动新的病害循环过程[12]，越冬前形成的菌核及越冬后萌发的菌核都是病害发生流行的关键环节。通过室内生物测定试验发现，武夷菌素能抑制核盘菌菌核的萌发，经27.74 µg/mL武夷菌素处理后菌核萌发产生子囊盘的萌发率降低了63.34%；同时，武夷菌素也能抑制菌核的形成，经16 µg/mL武夷菌素处理后，菌核形成的数量降低了78.64%，重量减轻了86.07%[9]。

3.2 削弱核盘菌的生理毒性

细胞壁降解酶和草酸是影响核盘菌致病力的重要因素，也是影响其生理毒性的重要指标[13]。核盘菌通过分泌一系列的细胞壁降解酶打破寄主植物的物理屏障，破坏植物组织，干扰内部正常的生理代谢过程，同时从寄主植株体内攫取所需的营养物质[14,15]。多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）和果胶甲基半乳糖醛酸酶（Pectinmethyl-galacturonase，PMG）是两种重要的细胞壁降解酶[16]。此外，核盘菌通过分泌草酸，降低病变部位的 pH，营造有利于核盘菌定殖与侵入的酸性环境[13,17,18]。利用二硝基水杨酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）测定武夷菌素对核盘菌产生的PG和PMG的活性发现，武夷菌素可以显著降低PG和PMG的活性。利用分光光度法测定武夷菌素对核盘菌合成草酸的影响，发现武夷菌素处理后草酸合成量显著降低[9]。这说明武夷菌素能够通过降低细胞壁降解酶的活性和减少草酸的合成，削弱核盘菌的生理毒性，阻碍定殖及侵入过程，抑制菌核病的发生流行。

3.3 影响核盘菌致病力及生长发育相关基因的表达

近年来，随着分子生物学的快速发展和核盘菌全基因组测序的完成，为从基因水平阐明武夷菌素抑制核盘菌的作用靶标奠定了基础。目前，研究报道了多种影响核盘菌生长发育和致病力的功能基因。其中，分泌蛋白Ss-Caf1与核盘菌侵染垫的形成有关，其突变体不能在健康叶片上致病[19]；类似整联蛋白（Ss-Integrin-like，SSITL）参与了核盘菌抑制寄主体内JA/ET信号途径介导的局部和系统性抗病反应[20]；NADPH氧化酶基因（SsNox1）不仅与ROS产生相关，同时也能影响核盘菌草酸的合成和菌核的正常发育[21]；pph1也调控核盘菌菌丝生长和菌核形成的生长发育过程[22]。通过实时荧光定量 PCR（Quantitative Real-time PCR）分析武夷菌素对核盘菌生长发育及致病相关基因转录水平的影响，发现在不同时间内武夷菌素显著下调了Ss-Caf1、SSITL、SsNox1和pph1表达量。其中，菌丝生长阶段，武夷菌素显著下调SSITL基因的表达；菌核发育期，武夷菌素下调Nox1、pph1、Caf1基因的表达；菌核成熟期，pph1基因受武夷菌素抑制下调表达；侵染寄主阶段，武夷菌素显著抑制Ss-Caf1和SSITL基因的表达[9]。这表明武夷菌素既能通过作用于SSITL、Ss-Caf1、Ssnox1减缓菌丝生长速度，抑制菌核的形成，进而影响核盘菌的生长发育，也能通过作用于Ss-Caf1和SSITL阻碍侵染垫的形成，抑制核盘菌负调控植物防御反应，降低核盘菌致病力，从而达到良好的保护效果。

4 武夷菌素诱导大豆抗菌核病的作用机制

4.1 诱导大豆体内胼胝质的沉积

植物诱导抗性的组织病理学反应是指植物通过生成促进胞壁合成的物质（如胶质体和胼胝质等）或修复、加厚细胞壁并使其木质化，从而增强植物抵抗病原菌侵染的第一道屏障[23]。其中，胼胝质沉积发生在病原体攻击部位的质膜和细胞壁之间，这种物理防御机制封闭胞间连丝间隙，阻止病原菌进入细胞，增强植物对入侵病原体的防御反应[24]。利用苯胺蓝染色法测定武夷菌素对大豆体内胼胝质沉积的影响，发现在被核盘菌侵染的大豆叶片中，武夷菌素能诱导大豆叶片中的胼胝质沉积。这证实了武夷菌素可以通过诱导植株体内胼胝质的沉积，从而增强大豆植株抵抗核盘菌侵染的能力。

4.2 提高防御相关酶的活性

农用抗生素能通过提高植物体内的防御相关酶活，增强植物的防御能力。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）和过氧化氢酶（Catalase，CAT）是植物体内主要的活性氧清除酶，它们通过催化代谢反应，清除植物体内因生物或其他非生物胁迫因子造成过量积累的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS），维持ROS的生成和清除之间处于动态平衡状态，避免 ROS造成的植物氧化损伤甚至死亡[25-27]。已有研究发现，利用分光光度法测定武夷菌素对核盘菌侵染的大豆叶片中 SOD、POD、CAT活性的影响，结果表明武夷菌素处理大豆叶片中活性氧清除酶的活性显著高于对照。这说明武夷菌素可通过减少植物对核盘菌侵染而引起的活性氧过度积累，维持活性氧平衡，提高植物对核盘菌的抵御能力。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）也是植物防御反应的关键生理指标之一。PPO能够催化植物体内的酚类底物，在有氧的条件下氧化生成醌类物质，而醌类物质对大部分病原菌具有较高的毒性从而起到抑菌或杀菌的作用[28,29]。PAL作为苯丙烷代谢过程中的限速酶[30,31]，其参与合成的酚类物质，是木质素、植保素和类黄酮等生物合成的基本分子。已开展的研究表明，利用分光光度法测定武夷菌素对核盘菌侵染的大豆叶片中PPO和PAL的活性发现，武夷菌素处理后，大豆体内PPO和PAL活性在不同时间段内都有显著的增强，这表明武夷菌素也能增强PPO和PAL活性，进而提高植物对核盘菌的抵御能力。几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶在植物抵御病原菌侵染过程中发挥重要作用[32,33]。β-1,3-葡聚糖酶不仅能水解真菌细胞壁中β-1,3葡萄糖键，通过裂解细胞壁使其细胞内的物质大量溢出，直接杀伤病原菌；还能诱导植物的其他防御酶发挥抗病作用[34]。几丁质酶可以将真菌细胞壁中的几丁质水解成N-乙酰低聚糖和葡萄糖，导致菌丝生长终止，甚至出现粗糙和畸形[28]。已开展的研究表明，利用分光光度法测定武夷菌素对核盘菌侵染的大豆叶片中几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的影响，发现武夷菌素处理后大豆叶片几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性高于清水处理组，表明武夷菌素能增强大豆体内几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性，破坏核盘菌细胞壁，直接阻碍核盘菌正常生长发育和侵染大豆植株的过程。

4.3 激活防御信号传导途径

水杨酸（Salicylic Acid，SA）、茉莉酸（Jasmonic acid，JA）、乙烯（Ethylene，ET）是3种重要的植物信号物质，也是植物防御反应的关键调控因子，在调控植物免疫反应中发挥重要作用[35]。SA主要参与调控植物对活体型或半活体营养型病原菌的防御反应，SA积累和信号转导是系统获得抗性（System acquired resistance，SAR）反应产生的必要条件。JA和ET主要参与植物应对死体营养型病原菌的防御反应，JA和ET则参与调控植物诱导系统抗性（Induced systemic resistance，ISR）的获得[36]。SA和JA/ET通路之间存在复杂的协同作用和交叉作用[37]。已有研究表明，农用抗生素能通过影响植物体内的防御反应信号传导过程，诱导或增强植物提高抗病性。如在探究申嗪霉素诱导烟草对灰葡萄孢Botrytis cinerea抗病作用的研究中，发现申嗪霉素能上调SA和JA/ET途径中关键协调因子NPR1的表达，激活烟草产生系统抗病性[38]。

通过选取SA和JA/ET信号传导途径中的关键基因（NPR1，PR1，PR4，MYC2，COI1，ERF1），利用实时荧光定量PCR分析不同基因在武夷菌素处理后的表达动态，研究武夷菌素是如何影响并调控大豆体内激素信号防御途径。COI1作为 JA信号通路的标记基因，与 JA-Ile相互作用，导致 JAZ（Jasmonate ZIM-domain）抑制因子通过26S蛋白酶体降解，从而减轻其对JA信号通路下游多种转录激活因子的抑制作用，激活JA信号传导途径[39]。在核盘菌侵染的大豆叶片中，武夷菌素在6～12 h时上调了COI1的表达。此外，还发现ERF1基因受武夷菌素诱导上调表达了3倍以上。有研究发现，ERF1是ET和JA信号通路的关键调控因子[40,41]。这表明武夷菌素在核盘菌侵染早期通过激活JA/ET信号传导途径，增强大豆防御核盘菌侵染的能力。据报道，JA/ET信号通路可以调控拟南芥中PR3、PR4和PR12等PRs基因的表达，在研究中发现武夷菌素也诱导增强了大豆体内PR4表达上调，进一步证实了武夷菌素通过影响大豆体内JA/ET信号传导途径参与抗核盘菌侵染的过程。此外，PR1是典型的SA信号传导途径的标记基因[42]。NPR1是SA和JA信号传导的关键调节因子[43]。在12～24 h内武夷菌素显著上调了SA信号通路的正向调控因子NPR1基因的表达，在12～36 h内武夷菌素也上调PR1表达，这表明SA信号通路也参与了武夷菌素诱导的防御反应。

5 展望

武夷菌素是我国具有自主知识产权的新型生物农药，对人畜低毒、与环境相容性好，是一种绿色安全的杀菌剂。研究武夷菌素防治大豆菌核病的作用机制，目的是提高武夷菌素对大豆菌核病的防治效果，为不断优化其田间应用技术提供科学依据。

目前，武夷菌素防治大豆菌核病的作用机制主要是从形态学和生理学角度分析，虽通过实时荧光定量PCR初步探究了武夷菌素与核盘菌及大豆互作的作用靶标，但仅局限于核盘菌生长发育和致病性及大豆体内防御信号传导途径这两方面，对核盘菌和大豆的其他生理生化代谢及信号传导等方面的机制还不清楚。后期可利用转录组学、蛋白质组学和生物信息学等技术手段，分析武夷菌素处理后核盘菌和大豆体内差异表达的基因或蛋白质，并使用转录组学和蛋白质组学数据的相关性分析来揭示对各类代谢途径的影响，深入探究武夷菌素-核盘菌-大豆三者互作的作用机制。