植物提取物对油茶炭疽菌的抑菌活性筛选

罗建梅，张兴怡，伍建榕,2，刘 丽，洪英娣，张东华*，闫晓慧*

（1. 云南省高校森林灾害预警控制重点实验室/西南林业大学生物多样性保护学院，昆明 650224；2. 西南地区生物多样性保育国家林业局重点实验室/西南林业大学林学院，昆明 650224）

油茶Camellia oleifera属山茶科Theaceae山茶属Camellia植物，是我国特有的油料植物[1]。用油茶果实精炼出的茶油不含对人体有害的黄曲霉毒素、棉酚、芥酸等成分，同时具有良好的保健功能，能减少脂肪的积累，提高人体免疫力，降低血浆中胆固醇浓度，改善和预防高血压、冠心病、动脉硬化等心血管疾病，是一种理想的高营养、低热量、高档保健食用油[2,3]。但油茶在种植的过程中病害发生较普遍，目前已有文献报道的油茶病害有 42种[4]，其中油茶炭疽病是最重要的病害之一，可引起严重的落蕾、落果，导致油茶减产20%～30%[5]。当下对于油茶炭疽病的防治主要是使用化学杀菌剂，但过多使用化学杀菌剂，不仅会影响茶油的品质，还会破坏生态环境、危害人类的身体健康，寻求新型环保的生物农药，生产绿色健康的茶油，是目前急需解决的问题[6,7]。植物是生物活性化合物的天然宝库，植物源农药有效成分为天然活性物质，具有见效快，易降解，有害生物不易产生抗药性，对非靶标生物安全，对环境友好等优势，倍受关注[8]。据统计，植物中的萜烯类、黄酮类、多酚类、生物碱等次生代谢物都具有杀虫或抗菌活性[9]。目前已报道的具有农药活性的植物约2400多种，其中抑菌植物超过1300种，主要集中在菊科、樟科、豆科、禾本科、唇形科、百合科等科[10,11]，我国拥有丰富的植物资源，尚有大量的植物种类未被研究。本研究测定了49种植物的70种提取物对油茶炭疽病菌的抑制作用，筛选出2种对油茶炭疽菌有较好抑制活性的植物提取物，为今后油茶炭疽病的生物防治提供新的思路，为开发植物源杀菌剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 植物材料共 49种，分别采自云南、辽宁和广西，由西南林业大学林学院胡世俊副教授鉴定，详情见表1。

表1 供试植物名录Table 1 The list of tested plants

1.1.2 供试菌株 油茶炭疽菌C. fructicola由西南林业大学生物多样性保护学院伍建榕教授提供。

1.2 试验方法

1.2.1 植物提取物的制备 植物材料风干粉碎，称取200 g的粗粉，甲醇超声提取3次，每次30 min，合并3次提取液，用旋转蒸发仪浓缩回收溶剂，得到甲醇提取物，水溶解后依次用石油醚、乙酸乙酯萃取得相应溶剂的提取物浓缩至干备用。精确称取一定量的提取物用二甲基亚砜（DMSO）溶解后配成100 mg/mL母液，置于4℃冰箱备用。

1.2.2 抑菌活性测定 已纯化的油茶炭疽菌菌种置于超净工作台上，菌落边缘打菌饼备用。采用带毒平板法[12,13]测定不同植物提取物对油茶炭疽菌的抑菌活性，将100 mg/mL母液采用巴氏消毒法灭菌备用。PDA培养基高压灭菌，冷却至 50 ℃以下，在无菌条件下将母液加入培养基中充分混匀，使提取物最终浓度为1 mg/mL，空白对照为含等量DMSO的PDA培养基，阳性对照为多菌灵。培养基凝固后，每皿中央接入一个菌饼（5 mm），每个处理3个重复，接种完成后用封口膜密封倒置放于28 ℃电热恒温培养箱中培养，每天采用十字交叉法测量菌落直径，直至对照组长满平板，计算抑菌率，纯生长量=菌落平均直径-5，抑制率（%）＝（对照纯生长量－处理纯生长量）/对照纯生长量×100。利用Excel和SPSS 19.0对数据进行方差分析。

1.2.3 抑菌毒力（EC50）测定 将臭灵丹石油醚萃取物和益母草乙酸乙酯萃取物设置0.25、0.5、0.75、1、2 mg/mL五个浓度梯度，阳性对照药剂为多菌灵，其浓度为12.5、25、50、100、200 µg/mL。采用1.2.2方法进行抑菌活性测定。将计算出的各浓度抑菌率换算成机率值，以浓度对数为x轴，抑菌率机率值为y轴，用Excel作图得出毒力方程求出EC50。

1.2.4 孢子浓度测定 取已培养好的油茶炭疽病菌的对照组和试验组培养皿，加入5 mL无菌水，将培养皿表面的孢子刮下，充分混匀，用脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣3次，使滤液体积达到10 mL，使用25中格的血球计数板，加适量的孢子悬浮液，在显微镜下观察左上、左下、右上、右下和中央5个中格即80个小格的孢子数，并计算孢子浓度。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂提取物的抑菌活性测定

26种植物的甲醇提取物在浓度为1 mg/mL时对油茶炭疽菌均表现出不同程度的抑菌活性（表2），其中唇形科植物益母草的甲醇提物对油茶炭疽菌的抑制率最高为44.03%，其次为菊科的藿香蓟40.30%，两种提取物抑菌活性无显著差异。此外茵陈蒿、角蒿、千里光和金腰箭也表现出较好的抑菌活性，抑制率均在30%以上，其余植物提取物的抑菌活性相对较低，抑菌率2.99%～29.10%。

测定了15种植物的乙酸乙酯萃取物在浓度为1 mg/mL时对油茶炭疽菌的抑菌率结果如表3所示，益母草乙酸乙酯萃取物对油茶炭疽菌的抑制率为50.75%，显著高于其他提取物，其次为柳叶菜科植物红花月见草的乙酸乙酯萃取物，抑制率为37.31%，其余植物的乙酸乙酯萃取物对油茶炭疽病菌的抑菌活性相对较低，抑制率5.22%～26.12%。

表3 15种乙酸乙酯萃取物对油茶炭疽菌的抑菌活性Table 3 Antifungal activities of 15 ethyl acetate extracts against C. fructicola

17种植物的石油醚萃取物在浓度为1 mg/mL时对油茶炭疽菌的抑菌率结果如表4所示，其中臭灵丹石油醚萃取物对油茶炭疽菌抑菌率为54.48%，显著高于其他植物，其次为红花月见草的石油醚萃取物，与扁蓄、篱天剑、薇甘菊、和钮子瓜等植物无显著差异，其抑菌率 30.6%～36.57%，马鞭草、千里光等 11种植物也表现出不同程度的抑菌活性抑菌率9.70%～26.12%。

表4 17种石油醚萃取物对油茶炭疽菌的抑菌活性Table 4 Antifungal activities of 17 petroleum ether extracts against C. fructicola

12种植物的水萃取物在浓度为1 mg/mL时对油茶炭疽菌的抑菌率结果如表5所示，其中钻叶紫菀水萃取物的抑制率最高为35.07%，其次为珊瑚樱，抑制率为33.58%，二者之间无显著差异，此外风轮草、倒提壶和益母草也表现出一定的抑菌活性抑制率，在 23.88%～29.85%之间，其余植物的抑菌活性较低，抑菌率8.96%～18.66%。

表5 12种水萃取物对油茶炭疽菌的抑菌活性Table 5 Antifungal activities of 12 water extracts against C. fructicola

2.2 臭灵丹和益母草提取物对油茶炭疽菌的抑菌浓度梯度筛选

对抑菌率较高的臭灵丹石油醚萃取物和益母草乙酸乙酯萃取物进一步进行了对油茶炭疽菌抑菌浓度梯度测定如图1所示，随着提取物浓度的增加，抑菌效果也越来越明显。分别在接种后的第3 d、第5 d、第7 d、第9 d测定了0～2 mg/mL范围内两种提取物的抑菌结果如图2、图3所示，以此结果为依据拟合出各提取物的毒力方程见表6，臭灵丹石油醚萃取物对油茶炭疽菌的有效中浓度（EC50）在 0.7013～0.7947 mg/mL之间，其中第5 d的测定的毒力最强。益母草乙酸乙酯萃取物对油茶炭疽菌有效中浓度（EC50）在0.6246～1.0021 mg/mL之间，在第9 d测定的毒力最强。但两种提取物的活性均不及阳性对照药剂多菌灵，其 EC50为 12.1567 µg/mL。

图1 臭灵丹、益母草提取物对油茶炭疽菌抑菌效果Fig. 1 Antifungal effects of extracts from L. pterodonta and L. artemisia against C. fructicola

图2 不同浓度臭灵丹提取物对油茶炭疽菌的抑菌效果Fig. 2 Antifungal effects of different concentration of L.pterodonta extract against C. fructicola

图3 不同浓度益母草提取物对油茶炭疽菌的抑菌效果Fig. 3 Antifungal effects of different concentration of L. artemisia extract against C. fructicola

表6 臭灵丹、益母草提取物对油茶炭疽菌的抑菌毒力Table 6 Toxicity of extracts from L. pterodonta and L. artemisia against C. fructicola

通过显微观察发现臭灵丹石油醚萃取物处理的油茶炭疽菌菌丝形态发生了明显变化如图4所示，与对照相比，菌丝分支明显减少，菌体的产孢量也相对减少，用同一时间接种且长满菌丝的平板制作孢子悬浮液，在相同稀释倍数下利用血球计数板计数孢子量，对照组和处理组分别为6.55×106、2.8×106孢子/mL，可能由于提取物中的抑菌活性成分影响了油茶炭疽病菌菌丝的生长及孢子的产生，起到抑菌作用。

图4 臭灵丹提取物处理对油茶炭疽菌菌丝形态和产孢的影响（10×40倍）Fig. 4 Effects of L. pterodonta extract on mycelial morphology and sporulation of C. fructicola (10×40 times)

3 讨论

目前，油茶炭疽病的防治主要采用化学药剂，大量使用化学药剂会危害有益生物、破坏生态环境、威胁人体健康，导致了“3R”问题等，于是研究者们开始转变研究方向，从之前的化学药剂防治转变为生物防治和生物农药的开发[14,15]。现有的文献记载中，周建宏等[16]对 40多种植物进行抑菌活性测定，筛选出具有较高抑菌活性的丁香和黄芩，研制出了防治油茶软腐病和油茶炭疽病的纯植物源农药。李石磊等[17]将从博落回中提取出的有效成分与化学药剂复配，研制出了复配药剂，对防治油茶炭疽病、油茶软腐病和油茶叶枯病具有抑制作用。杨婷等[18]通过研究发现，香芹酚、丁香酚、异丁香酚对油茶炭疽菌具有良好的抑制作用。李昕[19]对苦楝、黄苓、茶枯、博落回4种植物提取物进行抑菌活性测定及室内毒力分析结果表明，浓度为500 mg/L的博落回提取物对油茶炭疽菌的抑制效果最好，抑菌率达71.70%，其EC50为149.88 mg/L。姚翰文等[20]研究发现丁香提取物对油茶炭疽菌具有良好的抑制效果，其EC50值为1.005 g/L，本试验中发现的臭灵丹提取物的EC50在0.7013～0.7947 mg/mL之间，益母草提取物的EC50在0.6246～1.0021 mg/mL之间，抑制效果相对优于丁香的提取物，具有更高的利用价值。由此可见，从植物中寻找高效低毒的绿色农药用于油茶炭疽病的生物防治具有广阔的前景。

本研究发现臭灵丹和益母草的提取物对油茶炭疽菌的生长和繁殖均具有较好的抑制活性。臭灵丹Laggera pterodonta为菊科Compositae六棱菊属Laggera植物，别名狮子草、臭叶子、六棱菊等，分布于云南、四川、湖北、广西、西藏等地[21]，具有抑菌、抗肿瘤、抗病毒等生物活性，被广泛用于治疗感冒、咽喉炎、支气管炎、疟疾等，主要化学成分为桉烷型倍半萜和黄酮类化合物，目前已从臭灵丹中分离、鉴定出30余种桉烷型倍半萜类化合物[22]。杨光忠等[23]研究发现臭灵丹酸、臭灵丹二醇对金黄色葡萄球菌、草分支杆菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、环状芽胞杆菌具有明显的抑制作用，目前对于臭灵丹的化学成分研究与应用主要是在医学方面，其他方面的报道相对较少。益母草Leonurus artemisia又名坤草，属唇形科Labiatae益母草属Leonurus植物，在全国各地均有分布，其药用部位为干燥或新鲜的地上部分[24]，主要用于医学方面，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒等功效[25]。目前，从益母草中已分离鉴定出120余种化合物，包括生物碱类、黄酮类、二萜类、香豆素类、三萜类、苯乙醇苷类、挥发油类等化合物[26]。马庆一等[28]采用滤纸片扩散法研究表明，益母草对多种细菌、青霉都具有良好的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌抑制效果较为明显[27]，同时有研究表明益母草中的黄酮类化合具有良好的抗菌作用。通过本试验结果可知，菊科和唇形科植物对油茶炭疽菌的抑菌活性相对高于其他科的植物。同种植物不同溶剂提取物的抑菌活性存在一定的差异，从抑菌结果可知，对于油茶炭疽病菌，益母草活性最好的是乙酸乙酯提取物，其次是甲醇提取物，水提取物的抑菌效果相对较差；臭灵丹石油醚提取物的抑菌活性远高于水提取物。根据已有的文献报道，乙酸乙酯提取物中的黄酮类化合物含量最高，而水提取物中的主要化学成分是多糖[29]，可见抑菌活性成分主要集中在乙酸乙酯和石油醚萃取物中。今后可进一步追踪益母草的乙酸乙酯萃取物和臭灵丹的石油醚萃取物对油茶炭疽病的抑菌活性成分并研究其抑菌机制，进而为油茶炭疽菌生物防治及植物源杀菌剂的研制提供更多的理论支持。