FAM20C在牙齿形成中的局部作用的研究进展

王 宁，谢晓华

FAM20C以前也被成为牙本质基质蛋白4(dentin matrix protein 4,DMP4)，是一种分泌型激酶，属于FAM20蛋白家族[1]。在哺乳动物中FAM20家族有3个序列相似的成员:FAM20A、FAM20B和FAM20C[1]。FAM20A本身没有激酶活性，但可以与FAM20C形成复合物从而增强其蛋白激酶活性，它的突变与人类牙釉质发育不全、牙龈增生综合征和牙釉质-肾脏综合征有关[2]。FAM20B负责糖胺聚糖-蛋白连接区中木糖残基的磷酸化，可以参与斑马鱼的软骨基质生产和骨骼发育[3]。最新研究表明，FAM20B的特异性失活与小鼠牙齿数量有关[4]。以往研究表明，FAM20C在牙体组织的成骨细胞、成牙本质细胞、成釉细胞和成纤维细胞以及牙釉质、牙本质和骨基质中高表达[1,5]，能够磷酸化SCPP蛋白，认为FAM20C的活性对于牙齿的形成至关重要。因此，本文就FAM20C的结构功能以及在牙齿发育中的局部作用作一综述，以便为牙齿形成的机制研究以及发育异常提供部分思路。

1 FAM20C的结构和分布

FAM20C基因位于染色体7p22.3，长度为72 410 pb，包含10个外显子[6]。FAM20C的mRNA 长度为3 176 pb，并具有1 755个核苷酸编码序列[6]。序列分析显示，FAM20C蛋白在N端包含579个氨基酸残基，包括一个假定的26个氨基酸信号肽[7]。C端含有350个氨基酸(对应于小鼠 FAM20C 序列中的 218～569)，被称为保守C末端结构域，并包含在不同物种之间高度保守的酪氨酸激酶结构域(KD)[1]，其KD包含222个氨基酸，从残基354～565[6]。人和小鼠的序列具有85%的一致性和91%的相似性[3]。FAM20C普遍表达在乳腺、脑、肾、脾、肝非矿化组织和牙齿、骨等矿化组织中。在牙齿的成釉细胞、成牙本质细胞、成骨细胞和成纤维细胞中高表达[5]。

2 FAM20C的功能

蛋白质磷酸化几乎可以调节细胞生命的各个方面，包括细胞周期、生长、分化、迁移和死亡[7]，是一个非常重要的生理过程，而FAM20C已被认定为是一种分泌性的蛋白激酶，它们在内质网(ER)的管腔中合成，并特异性定位于高尔基体和细胞外[8]，主要磷酸化 Ser-x-Glu/pSer 基序中的蛋白质[9]。研究发现，FAM20C的底物有100多种蛋白质，其中就包括SCPP蛋白家族。SCPP蛋白家族包括小整合素结合配体N连接糖蛋白(SIBLINGs)和釉基质蛋白，SIBLINGs包括骨唾液蛋白(BSP)、骨桥蛋白(OPN)、牙本质基质蛋白-1(DMP1)、牙本质唾液涎磷蛋白(DSPP)和基质细胞外磷酸糖蛋白(MEPE)。釉基质蛋白包括釉成熟蛋白(AMTN)、成釉蛋白(AMBN)和釉蛋白(ENAM)[10-12]。这是两组对骨骼和牙齿形成至关重要的细胞外基质蛋白，在骨骼和牙齿的矿化中起着重要作用。

小鼠中FAM20C的整体失活会导致FGF23介导的低磷酸盐血症，并伴随骨骼和牙齿的严重变化[12]，还会引起睾丸、精囊、前列腺、鲍曼氏囊、唾液腺和其他器官的变化[13]。人类FAM20C基因的突变与致死或非致死性Raine综合征有关，该综合征的特点是全身性骨硬化、颅内钙化和颅面畸形[14]。除生物矿化外，FAM20C在其他的生物过程中也起作用，例如脂质稳态、伤口愈合、细胞迁移和黏附等[15]。

3 FAM20C对牙源性相关干细胞的影响

3.1 FAM20C对牙髓干细胞的影响

人类牙髓细胞(hDPCs)来源间充质于具有高增殖和自我更新的能力，并具有分化为成牙本质细胞样细胞的能力。它们是修复性牙本质生成所必需的[16-17]。研究发现，牙髓细胞向成牙本质细胞分化中FAM20C以时间依赖性方式升高，在第14天时，FAM20C蛋白的表达水平最高，与此同时，DSPP和DMP1的表达上调[18]。体外敲低DPC中FAM20C后，FAM20C的蛋白表达水平下降60%，也抑制了DPC中DSPP和DMP1的蛋白表达，降低了碱性磷酸酶(ALP)的活性，减少矿化结节的形成[18]。另一研究表明，FAM20C表达于诱导前后的hDPC中，未诱导时FAM20C在细胞核中表达，诱导后表达于细胞质中，且胞质中FAM20C的表达量随时间而增加[19]。以上研究提示FAM20C参与调节hDPC向成牙本质细胞的分化，并推测在分化过程中是从胞核转向胞质发挥磷酸激酶的作用[19]，但其具体机制有待进一步研究。

3.2 FAM20C对间充质干细胞的影响

牙齿发育是上皮和间充质相互诱导的复杂的过程，除釉质外，其他牙体组织均由间充质细胞发育而来，因此，了解FAM20C对间充质细胞的影响至关重要。有学者用体外慢病毒转染的方法生成了FAM20C敲除的牙齿间充质细胞系，发现FAM20C的失活抑制了间充质细胞迁移和增殖能力，抑制牙源性相关标志物，即ALP、DMP1、DSPP、BSP、MEPE和OPN的mRNA以及蛋白的表达水平，减少矿化结节的形成[20],却提高BMP2和BMP7的表达[20]。

4 FAM20C在牙体硬组织发育中的作用

4.1 FAM20C促进釉质的形成和矿化

釉质发育不全(amelogenesis imperfecta，AI)是一类遗传性疾病，在釉质的形成和矿化中表现出一定的缺陷。AI常表现出稀薄、柔软、易碎、凹陷和变色的釉质表型。据报道，这些缺陷也可能与其他器官的系统病变有关[3]。因此，了解AI的生物学机制可以为临床提供有效的治疗手段。目前，多项研究表明，AI的出现与FAM20C的功能丧失密切相关[3，21]。再次证明FAM20C的活性对釉质的形成和矿化至关重要。

Wang等[12]构建K14-Cre;FAM20Cfl/fl小鼠在上皮组织中特异性失活FAM20C，结果导致敲除鼠的牙齿透明度下降，表明釉质发育或者矿化不良。另外，Liu等[21]构建了Sox2-Cre;FAM20Cfl/fl小鼠模型普遍失活FAM20C，导致小鼠门牙较短且有白垩色外观，第一磨牙表面粗糙且成淡黄色。进一步研究发现，成釉细胞形态与原来的高柱状相比变得矮小，失去极性且混乱，细胞外基质成球状且易脱落，矿物质沉积速率显著降低[12,21]。推测出现上述表型的原因可能：一方面成釉细胞与釉质表面之间的锥板结合受到损害，导致成釉细胞与最初分泌的釉质基质脱离；另一方面，分化差的成釉细胞分泌不规则的釉质基质样物质，并且不能黏附在基质上，导致成熟牙齿表面的釉质层缺损。

分子水平研究发现，FAM20C缺失下调了成釉细胞标志物成釉蛋白AMBN和AMTN的mRNA和蛋白质表达水平[12]，BMP 信号传导途径的关键调节因子Smad 1/5/8的水平显著降低，BMP的配体(在前釉母细胞和成釉细胞中表达)BMP2、BMP4和BMP7水平降低，而BMP2、BMP4和BMP7的基因表达没有改变[21]。BMP配体是FAM20C的磷酸化底物，BMP信号通路，尤其是依赖于Smad 的BMP通路，在成釉细胞的分化和成熟中起着至关重要的作用[12]。体外成骨细胞中失活FAM20C的研究也表明，FAM20C缺失会降低p-Smad1/5/8，p-Erk和p-p38的水平[22]。因此推测，FAM20C不仅促进成釉细胞的分化和成熟，还参与细胞外基质的形成和矿化，FAM20C缺失导致的小鼠牙釉质缺陷一方面受釉质基质蛋白的调控作用，另一方面也与BMP配体的磷酸化失败而抑制了BMP信号通路的激活有关。

4.2 FAM20C促进牙本质形成及相关机制

牙本质发育不全(dentinogenesis imperfecta,DGI)是一种常染色体显性遗传病，其特点是牙本质矿化不良和结构改变[23-24]。了解DGI的形成机制对于临床诊断和治疗非常有意义。

Wang等[25]构建了Sox2-Cre;FAM20Cfl/fl小鼠使FAM20C普遍失活，同时构建了Wnt1-Cre;FAM20Cfl/fl小鼠灭活颅面间充质细胞中的FAM20C，2种敲除小鼠都表现出牙本质变薄，牙齿变短，第一磨牙萌出迟缓，根部不完整。还有研究也表明，在FAM20C敲除鼠中，牙本质小管数量减少，排列不规则，髓腔增大，磨牙的牙髓腔中缺乏反应性牙本质[5]。体外功能的获得和丧失表明，FAM20C的过表达促进成牙本质细胞的分化并促进矿化的结节形成[13]。另外，通过RNA干扰使FAM20C沉默可抑制成牙本质细胞的分化和矿化作用[13]。以上都说明FAM20C对于牙本质尤其是根部牙本质的形成至关重要。

牙本质细胞外基质由90%的Ⅰ型胶原和10%的非胶原蛋白组成，其中，非胶原蛋白DMP1和DSPP在调控成牙本质细胞分化和成牙本质细胞外基质的形成和矿化过程中起重要作用[26-27]。多项研究表明，在FAM20C失活的成牙本质细胞中，DSPP和DMP1的表达下调，且DSPP在根部牙本质比在冠部牙本质下调严重的多，几乎被废除[25]，这也与根部牙本质缺损比冠部牙本质缺损严重相符合，提示牙冠部存在着其他分子信号调节补偿机制，但目前尚不明确。Wang等[28]进行DMP1过表达的挽救实验，多项数据表明并没有改善牙本质缺陷的情况，推测DMP1的下调可能不与FAM20C基因敲除小鼠的矿化缺陷直接相关。

蛋白质糖基化是最为常见且复杂的翻译后修饰之一[29]。DSPP和DMP1在水解过程中被剪切成N端和C端，糖基化集中于DSPP和DMP1的N端，且能够抑制C端促进矿化的作用[30]。研究发现，FAM20C敲除鼠的DSPP/DSP的比率明显升高(DSP是DSPP的N端片段)，且DSPP部分的弥散增大。全长DMP1/C端DMP1的比率也出现升高，而其N端DMP1片段浓度降低，弥散程度加大[30]。由此推测FAM20C缺失会降低DSPP和DMP1的磷酸化程度，而提高了糖基化水平，从而抑制了DSPP和DMP1的剪切进而抑制了牙本质的矿化作用。

5 FAM20C维持牙周组织的正常形态和健康

牙周支持组织包括牙周膜(PDL)、牙骨质、牙槽骨和牙龈[31]。PDL是牙骨质和牙槽骨之间的一种未矿化的结缔组织，其功能是以防止咀嚼时牙齿受到意外损伤[31]。众所周知，成纤维细胞能产生Ⅰ型胶原，是PDL中最主要的成分，也是上述功能的主要承担者。研究发现，在表达Ⅰ型胶原的细胞中灭活FAM20C,会导致小鼠牙周出现进行性缺损并伴有炎症的发生[32]。出生第4天时，敲除组与对照组区别不大，没有牙周袋形成，在24周时区别最为严重，表现为多数牙槽骨丢失，牙周膜的某些区域坏死并伴有脓肿的形成，几乎所有胶原纤维都被破坏[32]。Vogel等[3]研究也表明，FAM20C-/-小鼠的磨牙常伴有根尖脓肿，牙周炎和牙槽骨的变化。综上，FAM20C缺失会破坏纤维组织和骨组织的形成，引起牙槽骨的破坏和牙周炎症，FAM20C的活性是维持正常牙周形态以及牙周健康所必需的。

除Ⅰ型胶原外，其他细胞外基质分子也在牙周组织中起重要作用，骨膜蛋白Periostin就是其中之一。在FAM20C敲除鼠中，牙周膜中Periostin的表达显著降低[33]。而在Periostin敲除小鼠中，PDL成纤维细胞在胶原纤维中不规则分布，并且胶原纤维杂乱无章[33]。以往研究表明，Periostin促进细胞与基质相互作用，促进细胞存活，调节胶原蛋白Ⅰ原纤维形成并与其他ECM蛋白相互作用，在ECM的连接和分布中起重要作用[34]。最近研究发现，Periostin是FAM20C的潜在底物，能直接与FAM20C结合，体外被其磷酸化[35]。因此推测FAM20C可能是通过影响骨膜素的细胞功能以及减弱其磷酸化作用来影响牙周组织结构的。

6 总 结

细胞外基质的生理钙化或生物矿化是完成正常的发育过程所必须的，对于牙齿等矿化组织的正确形成和功能至关重要。FAM20C作为一个负责磷酸化的激酶，在成釉细胞、成牙本质细胞、成骨细胞和成纤维细胞中高表达，促进牙釉质和牙本质的形成和矿化，参与牙周形态的正常形成和牙周健康的维护。但是，目前牙齿发育的机制尚不明确，对某些方面还有待进一步研究，例如，FAM20C对底物的磷酸化作用以及与其他信号分子的联系。在以后的研究中，可以在这方面进行深入研究，进一步了解牙齿发育的机制，为临床治疗和科研提供新的思路。