不同灭酶条件下油体得率、成分的变化及油体性质分析

孙 婕， 刘亦菲， 尹国友

(河南城建学院生命科学与工程学院，平顶山 467036)

大豆营养价值丰富，是世界上一种重要的油料作物，可为人类膳食提供优质的蛋白质和油脂。大多数植物种子在油体内储存脂类物质[1，2]。油体，也称为类脂体，是储存类脂物质的亚细胞器颗粒，是一种直径为0.2～0.5 μm 的球体，主要由三酰甘油酯(TAG)、磷脂(PL)和油体相关蛋白组成[3]。大豆油体(SOB)富含对人体健康有益的脂溶性生物活性物质，如磷脂、生育酚、异黄酮、多不饱和脂肪酸、植物甾醇、蛋白质、脂质等物质[4]。此外，大豆油体是来源于大豆的预乳化油的天然来源，可以分散在水介质中形成稳定的乳化体系[5]。由于其特殊的结构、有益的功能成分及良好的稳定性，在食品、美容和医药保健领域具有广阔的应用前景。

由于大豆油体特殊的结构、有益的功能成分及良好的稳定性，近年来，对于油体的研究越来越多，特别是在油体结构、理化性质、应用领域等方面，例如，傅礼玮等[6]以大豆油体为主要原料，作为乳化剂，将其固体脂肪含量调整到适合于搅打稀奶油体系，并对大豆基搅打稀奶油理化性质进行研究，为天然稀奶油的制备提供了有力依据。居巧苓等[7]将生豆浆调酸处理，实现大豆油体富集物的分离，制得低脂大豆蛋白液。何胜华等[8]研究了大豆和油菜籽油体形成的天然乳液，并考察了2种油体乳液在环境应力下的稳定性和在胃肠道消化过程中的微观变化。韩昊天等[9]以大豆油体富集物为天然乳化剂，研发并优化了一款新型乳品，为未来大豆油体富集物在乳制品中的应用提供依据。

提取大豆油体过程中会产生许多副产物如豆渣和脱脂豆浆，这些副产物在实际生产排放到环境中会造成严重的污染。因此，有必要对大豆油体提取过程中产生的副产物进行研究和开发。本文首先对大豆或豆浆进行了不同条件下的热处理，在不同灭酶处理的基础上提取大豆油体，对不同条件下大豆油体得率进行计算、测定其基本成分、稳定特性和流变性质，旨在确定大豆油体提取的最佳灭酶热处理工艺。在此基础上，对提取品质综合评定较高的大豆油体进行应用分析，即探索大豆油体在不同pH、NaCl浓度、温度、加水量处理条件下的稳定性和流变性，还对大豆油体提取过程中产生的豆渣、脱脂豆浆进行基本成分的测定，这为大豆油体应用时的加工工艺、质量稳定控制和设备设计，以及豆渣和脱脂豆浆的再利用等方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆，蔗糖、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、石油醚、氯化钠、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、甘氨酸、Tris、Acrylamide、TEMED、β-巯基乙醇、考马斯亮蓝、甘油、溴酚蓝、甲醇、醋酸。

1.2 仪器与设备

DC10-K10超级恒温水浴锅，YN6-0.7-D全自动电加热蒸汽发生器，DS-1高速组织捣碎机，华烨HYP-308消化炉，华烨KDN-103F自动定氮仪，DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱，DL-10MD大容量高速冷冻离心机，ULTRA-TURRAX高速分散机，Mastersizer2000激光粒度仪，Nano ZS电位及纳米粒度分析仪，HAAKE MARSⅢ流变仪，Mini-PROTEAN Tetra cell电泳仪。

1.3 方法

1.3.1 大豆油体制备

参照Chen等[10]的水提法并略作改动。用去离子水浸泡大豆10～12 h后，按照大豆比水1∶3的比例加入去离子水于高速组织捣碎机中进行磨浆，磨浆后进行浆渣分离得到豆浆，然后按照豆浆与蔗糖质量比4∶1的比例加入蔗糖并混匀后与高速冷冻离心机内于4 ℃，6 500 r/min，离心30 min，再经2层纱布过滤即得到大豆油体，并放置于4 ℃备用。

表1 灭酶处理条件

1.3.2 大豆油体提取前对大豆或豆浆的不同灭酶处理

1.3.3 大豆油体提取率计算[11]

大豆油体提取率=m2/m1×100%

(1)

式中：m2为提取的大豆油体总质量/g；m1为干大豆的质量/g。

1.3.4 大豆油体、豆渣及脱脂乳内基本成分含量的测定

为了考察大豆油体提取过程中整个提取工艺物料的流动情况，并且为豆渣和脱脂豆浆的回收提供数据，测定了大豆油体、豆渣、脱脂豆浆内的蛋白质、脂肪、含水量的变化[12-14]。

1.3.5 大豆油体粒径、电位的测定

油体粒径大小是油体聚合物乳液的重要性能，能表征乳液物理稳定性，直接影响到其相关产品的加工和应用。取得到的各种油体各5 g并加入45 mL、pH7.0, 10 mmol/L的磷酸缓冲溶液于高速分散机内制成乳化液，测试温度为25 ℃。

1.3.6 大豆油体流变性质的测定

流变仪条件：锥形板与平台之间的间隙1 mm。黏度扫描：使用PP35Ti锥板，剪切速率范围为0.100 0～100.0 s-1。频率扫描：使用C35 2°Ti L锥板，进行动态频率扫描。频率扫描范围为0.100 0～20.0 Hz。

1.3.7 大豆油体及脱脂豆浆中蛋白组成分析

加热处理对于内源蛋白和外源蛋白均有影响[15]，以未加热处理条件下大豆油体、脱脂豆浆为对照，探究灭酶加热处理之后油体中蛋白的变化。SDS-PAGE实验参照Wang等[16]的方法，即分离胶12%、浓缩胶4%，上样量20 μL，初始电流为20 mA，溴酚蓝指示剂进入分离胶后，调整电流为40 mA。考马斯亮蓝染色2 h，脱色后于凝胶成像系统拍照。

1.3.8 大豆油体应用分析

1.3.8.1 不同pH条件下大豆油体的乳析稳定性、粒径、电位的测定

取1.3.2步骤得到的大豆油体50 g并加入450 mL pH7.0，10 mmol/L的磷酸缓冲溶液于高速分散机内制成乳化液，然后取7等份量为50 mL的乳液，用0.1 mol/L的HCL和0.1 mol/L的NaOH调乳液pH为2、3、4、5、6、7、8。取10 mL放置于离心管放置24 h测量其乳析稳定性，乳析稳定性的结果利用乳化系数进行表示，计算方法见式(2)[17]。

(2)

式中：CI为乳化系数；He为静置24 h后乳液层的高度；Ht为体系总体高度。

1.3.8.2 不同NaCl浓度下大豆油体乳析稳定性、粒径、电位的测定

取1.3.2步骤得到的大豆油体5 g，用含NaCl浓度为0、10、25、50、100、150 mmol/L的pH7.0的10 mmol/L的磷酸缓冲液各45 mL配制成不同浓度的乳液，各取10 mL于离心管中，放置24 h测其乳析稳定性。

1.3.8.3 不同温度下大豆油体乳析稳定性、粒径、电位的测定

取1.3.2步骤得到的油体50 g，加入pH7.0的10 mmol/L的磷酸缓冲液450 mL配制成乳液，分装于不同10 mL离心管中，于-20、4、20、30、40、50、60、70、80、90 ℃条件下放置30 min后再放置24 h测其乳析稳定性。

2 结果与分析

2.1 不同灭酶热处理条件下大豆油体的提取及性质分析

2.1.1 大豆油体提取率

从图1中可以看出，高压蒸汽灭酶热处理条件下的提取率最高，分别为33.58%、37.57%、33.44%。豆浆灭酶热处理方法的提取率次之，涨豆进行30 min热处理的方法提取率最低。有研究表明短暂的加热时间可以改变蛋白质的二级结构，导致部分变性，从而蛋白表面的疏水性增加，使得油体的外源蛋白附结在油体蛋白上，油体提取率会增加[18]。但这种油体具有极大的不稳定性，外源蛋白会随着理化性质的变化而脱离油体使得油体在应用时有乳清析出特别明显的状况。未处理条件下得到的油体提取率与章书婷[19]对大豆在不加处理的情况下的回收率(24.58%)相差不大，豆浆灭酶处理提取率比较接近未处理，而对涨豆进行灭酶处理条件下大豆油体提取率较低，不适合工业化生产。

注：处理条件1～3分别表示高压蒸汽(110±5)℃、10 s，高压蒸汽(120±5)℃、10 s，高压蒸汽(130±5)℃、10 s，处理条件4～9分别表示70 ℃浸泡涨豆 30 min，80 ℃浸泡涨豆 30 min，豆浆65 ℃、30 min，豆浆75 ℃、30 min，豆浆85 ℃、30 min和未处理。余同。图1 不同灭酶热处理条件下大豆油体的提取率

2.1.2 大豆、油体、豆渣及脱脂乳内基本成分含量对比

从表2中数据可知，大豆中蛋白质量与脂肪质量比约为1∶0.68，未处理油体中蛋白含量与脂肪含量比约为6.30∶1，这说明，未处理条件下得到的油体比较纯，没有其他的杂质。从已有研究提取的油体湿基中来看，一般脂肪质量分数在30%～40%，蛋白质量分数一般在5%左右[19,20]，这也符合纯油体的组分特征，即脂质占整个油体质量的92%～98%，蛋白约占整个油体质量的1%～4%。而高压蒸汽灭酶条件下的油体，蛋白与脂肪含量明显不符合大多数人油体湿基组分特征，其蛋白含量相对脂肪含量较高，豆浆灭酶处理条件下得到的油体的基本成分含量比较接近未处理，且75 ℃、30 min条件下的油体最接近未处理，也符合大多数人油体湿基含量特征。

表2 各种油体及大豆成分含量对比

表3和表4可得知，大豆油体提取过程中的残渣和脱脂豆浆具有回收价值，豆渣中还残留有4%左右的蛋白和1.5%左右的脂肪，且除蛋白和脂肪外，其余的组分为和大豆中相同的多糖、纤维素等碳水化合物。脱脂乳中主要成分为水，还含有少量的蛋白和脂肪。从大豆油体提取的角度讲，高压蒸汽灭酶条件下豆渣中残留的蛋白与脂肪含量较高，涨豆浸泡灭酶处理次之，未处理和豆浆灭酶处理条件下豆渣中残留蛋白与脂肪含量最少。

表3 各种豆渣中成分含量对比

表4 脱脂乳中成分含量对比

图2 不同灭酶条件下大豆油体粒径的变化

2.1.3 大豆油体稳定性质分析

粒径和电位是表征油体稳定性的两个常用指标，由于油体表面蛋白残基带有负电荷，所以油体呈现为负电位，并且油体表面带的负电荷越多，油体之间斥力越大，油体越稳定[21]。大豆油体的直径一般为0.2～0.5 μm之间，粒径较小，油体较纯，油体表面没有多余的外源蛋白，油体较稳定。图2为不同灭酶条件下的油体的粒径，高压蒸汽灭酶条件下油体粒径已经超出正常范围，说明大豆油体提取不纯，有较多的外源蛋白聚集在大豆油体的表面。浸泡涨豆灭酶条件下得到的大豆油体粒径与豆浆灭酶条件下大豆油体粒径相差不大，且豆浆灭酶条件下大豆油体粒径更小也在正常范围之内，大豆油体较纯，75 ℃、30 min豆浆灭酶条件下，大豆油体粒径最小。图3所示为电位变化，未处理条件下得到的大豆油体电位绝对值最大，高压蒸汽灭酶条件下油体电位绝对值随着温度升高而增大，这与粒径的大小相符合，说明在热处理时间短暂的条件下大豆油体的稳定性是随着温度增加而上升的，其他条件下大豆油体电位绝对值相差不大，但都处于稳定状态下大豆油体电位值范围之内，导致这样的原因可能是大豆油体表面蛋白含量多，种类丰富，在盐桥的作用下可以保持稳定[22]。

图3 不同灭酶条件下大豆油体电位的变化

2.1.4 大豆油体流变性质分析

2.1.4.1 黏度扫描

如图4所示，总体来看，在不同灭酶条件下得到的大豆油体样品的黏度随着剪切速率的增加而降低，均表现出剪切变稀的性质，假塑性流体最主要的特征就是黏度随着剪切速率的增大而下降[23]，因此大豆油体属于假塑性流体，可以将其直接应用到食品、药品等领域。在接近于零的剪切速率下，不同条件下得到的大豆油体表现出不同的表观黏度，其中高压蒸汽灭酶条件下和浸泡涨豆灭酶条件下的大豆油体表观黏度较大，多是由于油体表面外源蛋白与蛋白之间相互作用引起的。豆浆灭酶条件大豆油体测得的曲线拟合未处理曲线的效果比较好，且表现出较为合理的表观黏度。

图4 不同灭酶条件下油体、豆浆、浸泡涨豆黏度的变化

2.1.4.2 频率扫描

如图5所示，弹性模量均大于黏性模量，说明大豆油体中弹性成分占优势，表现出弱凝胶的性质，在频率扫描范围内，其弹性模量和黏性模量均随着频率的增大而增大，其流变学特征依赖于频率变化说明油体在动态过程中是一种黏弹性体系。未处理大豆油体的扫描频率为0.159 2 Hz时的弹性模量和黏性模量值为353 Pa和78 Pa，与吴娜娜等[24]的研究大致相同，未处理条件下大豆油体在0.1～2.0 Hz的频率扫描范围内弹性模量和黏性模量的值增幅大于2～18 Hz频率范围内的，说明未处理条件下的大豆油体在低频率时表现出液体性质，在高频率时表现出半固体性质。由图5可以看出只有豆浆灭酶条件下得到的大豆油体的初始模量值与未处理相差不大，浸泡涨豆灭酶次之，高压蒸汽灭酶相差较大，一般来讲，这种蛋白质-脂肪体系的弹性模量值和黏性模量值不能太大，太大产品表现出极度不稳定性，故而要想使产品保持稳定性，必须在保持黏、弹性模量值比例不变的情况下降低产品的黏、弹性模量值。

图5 不同灭酶条件下大豆油体、豆浆、浸泡涨豆动态频率扫描

2.2 最佳工艺条件下大豆油体蛋白组成分析及应用分析

2.2.1 大豆油体及脱脂豆浆中蛋白组成分析

电泳图6显示的是未处理条件下和豆浆经75 ℃、30 min加热灭酶条件下大豆油体及脱脂豆浆中蛋白及蛋白亚基含量变化，通过电泳来表征油体表面蛋白的变化，从而表征大豆油体的稳定性。如图6所示，未处理条件下得到的大豆油体，其内源蛋白有少量24 ku和17 ku的oleosin异构体，大量29 ku的caleosin、39 ku的sterolesinA和41 ku的sterolsinB，由于浓度太大或含量太高，这些分子质量相差不大的蛋白条带聚集在了一起，导致条带颜色较浓[22, 25]。外源蛋白有β-伴大豆球蛋白即7S、7S有α`、α、β这三个亚基，分子质量为71、67、50 ku，另外还有11S球蛋白包括酸性A肽链(37～42 ku)和碱性B肽链(17～20 ku)[26]。由图6可知，未处理条件下提取的大豆油体均含有7S蛋白、11S蛋白，11S蛋白含量较多，但是经过75 ℃、30 min的豆浆灭酶之后，大豆油体的这些外源蛋白大部分被去除，只含有24 ku的oleosin蛋白，39 ku的sterolesinA和4 1 ku的sterolsinB内源蛋白和少量外源蛋白，说明经过灭酶处理后得到的大豆油体较纯，杂蛋白较少。另外，脱脂豆浆中还含有大量的蛋白，但从其条带来看，大部分为大豆油体外源蛋白，灭酶对其组分无影响。

图6 电泳结果

2.2.2 不同pH条件下大豆油体的乳析稳定性、粒径、电位结果分析

如图7所示，乳化系数在pH2和pH3的条件下为零，pH5的条件下乳化系数最大，从乳化稳定性方面来说，酸性条件下大豆油体比较稳定，而pH5左右的乳液体系本来分散在水相的大豆油体发生了聚集，导致乳清析出，乳液表现为极不稳定。粒径在酸性条件和碱性条件属于油体正常范围，而在pH5附近，大豆油体粒径变大，不在大豆油体粒径正常范围，此时大豆油体发生聚集，粒度仪检测的是多个大豆油体的聚集体，大豆油体不稳定。正符合油体所处pH小于7时，油体膜表面的油体蛋白中存在的组氨酸残基会中和油体膜表面原存在的负电荷，致使油体表面蛋白的电位值降低，导致油体絮凝失稳[27]。且大豆油体电位在pH4～pH5之间的某一点为零，说明大豆油体的等电点在4～5之间[22]。乳析稳定性结果与粒径和电位表征大豆油体乳液稳定性的结果相一致，说明大豆油体可用于酸性和碱性产品中。

图7 不同pH条件下大豆油体乳化系数、平均粒径、电位的变化

2.2.3 不同NaCl浓度下大豆油体乳析稳定性、粒径、电位结果分析

如图8所示，大豆油体的乳化系数随着NaCl浓度的增大而变大，粒径也NaCl浓度的增大而变大，电位绝对值随着NaCl浓度的增大变小，这与何胜华等[7]的研究一致，随着NaCl浓度的增大，钠离子的加入中和了油体表面蛋白的负电荷，使得大豆油体表面带电量减小，电位下降，大豆油体之间静电斥力减小，大豆油体易于聚集，大豆油体粒径变大，乳化系数增高。但是在低NaCl浓度条件下，大豆油体之间的不稳定性差距不明显。因此大豆油体可用于低盐条件下的产品。

图8 不同NaCl浓度条件下大豆油体乳化系数、平均粒径、电位的变化

2.2.4 不同温度下大豆油体乳析稳定性、粒径、电位结果分析

由图9可知，除冷藏温度外，大豆油体的乳化系数大致随着温度的增高而变低，温度对粒径没有明显的影响，电位除了冷存温度外逐渐减小，热处理导致油体表面蛋白分子结构发生变化，结构舒展，疏水性能增加，大豆油体乳液的乳化性能变好，可溶性较高，这与Li等[5]的研究大多一致。冷藏处理对大豆油体粒径和电位无影响。

图9 不同温度条件下大豆油体乳化系数、平均粒径、电位的变化

2.2.5 不同pH条件下大豆油体乳液流变性结果分析

pH对乳液稳定性的主要影响是改变了油体液滴表面的电荷，从而影响了其液滴间的静电排斥作用，导致乳液会出现不稳定现象[28]。对豆浆灭酶条件下得到的大豆油体进行不同pH的处理，对其形成的不同pH的乳液进行稳态黏度扫描，结果如图10所示。总体来看，乳液黏度随着剪切速率的增加而减小，表现为剪切变稀，这与大豆油体表现为相同的性质，均为非牛顿流体中的假塑性流体。在pH2和pH3条件下的乳液在相同速率下的表观黏度最小，且其剪切变稀现象不明显。在接近于大豆油体PI的pH(4、5)条件下的大豆油体的表观黏度最大，这是由于不同的pH条件改变了油体表面蛋白的带电状况，甚至结构，从而大豆油体蛋白之间更易发生交联，相互作用，形成网状结构。尤其是接近于大豆油体PI时，大豆油体蛋白分子之间聚集，所以黏度增大。

图10 不同pH条件下大豆油体乳液黏度扫描

2.2.6 不同NaCl浓度条件下大豆油体乳液流变性结果分析

如图11所示，大豆油体乳液表现出剪切变稀的性质，属于非牛顿流体中的假塑性流体[29]，这与前面的研究相符合，随着NaCl浓度的增加，大豆油体乳液体系的黏度也随之增加，NaCl的加入使得大豆油体表面蛋白聚集，蛋白之间相互发生作用，容易形成网状结构，形成凝胶，增大黏度。从而体现大豆油体界面表现出更强的固相性，其大豆油体乳液在液滴聚结方面更稳定[30]。

图11 不同NaCl浓度条件下大豆油体乳液黏度扫描

2.2.7 不同温度条件下大豆油体乳液流变性结果分析

在实际应用中，大豆油体会遇到温度处理，在不同温度处理下，大豆油体乳液均表现出剪切变稀的性质，属于非牛顿流体中的假塑性流体[29]。结果显示，除冷冻温度外，随着温度的增加，大豆油体乳液的表观黏度逐渐变小，这与稀奶油表现出相同的性质，在工业中，若要增加大豆油体及乳液的流动性，可以用适当升温的方法。-20 ℃和4 ℃并不影响乳液的性质，因此可以应用其冷冻储藏。

图12 不同温度条件下大豆油体乳液黏度扫描

3 结论

不同灭酶热处理条件下大豆油体提取率不同，高压蒸汽灭酶条件下大豆油体的提取率最高，为33%～37%，但大豆油体蛋白含量较高，极不稳定，不利于直接应用；豆浆灭酶条件下大豆油体提取率约为20%，此时大豆油体蛋白与脂肪含量接近于未处理条件下的油体，比较稳定，利于直接应用；浸泡涨豆条件下大豆油体提取率最低，约为15%，不利于工业化生产与实际应用。综合评定，确定大豆油体的最佳工艺是豆浆75 ℃、 30 min的热处理，在此条件下，大豆油体的外源蛋白大部分被去除，只余有24 ku的oleosin蛋白，39 ku的sterolesinA、41 ku的sterolsinB内源蛋白和少量外源蛋白，大豆油体较纯，脱脂乳条带无明显变化，对回收具有意义。大豆油体、大豆油体乳液均属于假塑性流体，可以直接用于食品、药品等领域，也可用于酸、碱、低盐条件下的产品中。若增加或减少其表观黏度，或是在实际生产中确定使用某一黏度，可以根据不同条件下的流变学特性设置条件和参数。