益肾通络方对雌性小鼠卵子修复精子DNA能力的影响

赵莉娜，门波，陈建设，孙自学，张宸铭

（1. 河南省中医院，河南 郑州 450002；2. 河南中医药大学，河南 郑州 450046）

精子在生成、形成和成熟过程中，由于主要细胞器的脱落失去了DNA 损伤修复系统。因此，精子在成熟后不具备自我修复的能力，成熟的精子必须依靠卵母细胞中的修复系统来修复DNA损伤［1］。而卵母细胞的修复能力根据个体、年龄的不同呈现较大差异［2］。尤其是高龄女性会出现妊娠率低、流产率高等情况，这可能与卵子DNA修复功能密切相关［3］。

益肾通络方是本课题组前期临床使用近二十年的经验方，对于该方在改善精子质量方面，尤其是改善精子DNA 完整性方面的作用，做了大量的基础研究工作［4-7］，发现该方能够有效降低患者精子DNA 的碎片率，且安全性较高［8-9］。近年来，随着二胎、三胎政策的放开，高龄患者的就诊量明显上升。课题组根据中医“异病同治”理论，将该方应用于高龄女性患者，发现其可明显增加患者妊娠率、活产率，但具体机制不明。本研究通过复制苯并（a）芘（BaP）致雄鼠精子DNA 损伤模型，使正常雄鼠及BaP 染毒雄鼠分别与灌胃益肾通络方水煎液及灌胃生理盐水的雌鼠合笼，对比各组雌鼠的妊娠结局，探讨益肾通络方改善雌鼠卵子质量的作用机制。

1 方法

1.1 实验动物

20 只雄性、30 只雌性SPF ICR（CD1）小鼠（10 周龄，体质量30～40 g），购买于河南斯克贝斯生物技术有限公司，许可证号：SCXK（豫）2020-0005。对小鼠进行编号，然后依据随机数字表进行随机分组。所有动物实验和操作均已得到河南省中医院伦理委员会的批准。动物饲养在河南省中医院中心实验室的独立通风笼（IVC）系统中，许可证号：SYXK（豫）2011-0002。IVC 系统中，温度21～25 ℃，湿度38%～60%，通风量为22 次/h，光照/黑暗周期为12 h。小鼠可以自由进食标准动物饲料和过滤水。在正式实验之前，适应性喂养1周。

1.2 实验材料

益肾通络方组成：菟丝子20 g，淫羊藿20 g，黄芪20 g，丹参30 g，熟地黄10 g，牛膝10 g 和水蛭6 g，饮片购自河南省中医院中药房，所有药材均经河南省中医院制剂中心黄小敏主任药师鉴定。制备为3 g/mL的药材水煎液，保存在4 ℃的冰箱中备用。苯并（a）芘（BaP，分析纯，纯度≥96%）（批号：C11287800，北京德晟嘉行科技有限公司）；精子核完整性染色试剂盒（批号：201101，浙江星博生物科技股份有限公司）。

1.3 实验设计

20 只雄性小鼠随机分为两组，每组10 只，分别为A组和B组。A组小鼠（A1～A10）作为雄性空白对照组，灌胃与B组等量的生理盐水。B组小鼠（B1～B10）参照文献［10］进行BaP 染毒，染毒剂量为100 mg/（kg·d），共60 d，复制精子DNA损伤模型作为雄性造模组。同时，30 只雌性小鼠随机分为3 组，每组10 只，分别为C 组（C1～C10）、D 组（D1～D10）和E 组（E1～E10）。C、D 组小鼠作为雌性空白对照，灌胃与E 组等量的生理盐水，E 组小鼠按23.78 g/kg 剂量（按照体表面积法［11］计算的等效剂量）灌胃益肾通络方水煎液，共60 d。

灌胃结束后，采用角化细胞计数法［12］观察雌鼠动情周期。在雌鼠动情期时，将A 组每只雄鼠与编号相同的C 组雌鼠按照1∶1 比例合笼，一笼2 只，即A1 + C1、A2 + C2……A10 + C10。将B 组每只雄鼠与相同编号的D 组和E 组雌鼠按照1∶2 比例合笼，一笼3 只，即B1 + D1 + E1、B2 + D2 + E2……B10 +D10 + E10。合笼次日观察雌鼠阴栓情况［13］，发现阴栓则记为妊娠0 d，将雌鼠单独饲养直至F1 代出生，F1 代出生后统计每只雌鼠活产数。具体实验步骤见图1。

图1 技术路线图

1.4 SCSA法检测精子DNA碎片指数（DFI）

合笼成功后，采用戊巴比妥钠麻醉雄鼠，解剖后取附睾尾制成精子悬液，采用改良的精子染色质结构检测（SCSA）法［14］检测精子DFI。将精子悬液转移到800 μL的冷TNE缓冲液中，通过100 μm尼龙过滤器。将过滤后的精子悬浮液用相同的缓冲液稀释到（2 × 106～3×106）/mL 的浓度，然后用酸性洗涤剂溶液将100 μL的精子悬液稀释到200 μL，置于FACS 管中。加入600 μL 吖啶橙染色液，染色30 s。每个样本都用BD Accuri™C5流式细胞仪（BD Pharmingen，San Diego，CA，USA）对5 000 个精子进行门控分析。使用BD Accuri™C6 plus 软件（BD Pharmingen）计算DFI，并根据单链（红色）和双链（绿色）荧光比例计算精子DNA 碎片指数（sperm DNA fragmentation index，DFI）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，若数据符合正态分布且方差齐，则两组比较采用独立样本t检验；对于非正态分布或方差不齐的资料则采用t'检验。三组比较则采用单因素方差分析（ANOVA），并应用LSD 法进行各组间进行两两比较；对于非正态分布或方差不齐资料则采用秩和检验。P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况观察

各组小鼠毛发光泽，活动正常，雌鼠动情周期规律。雄鼠造模后未出现明显的外观变化。

2.2 两组雄鼠DFI情况比较

合笼成功后，处死所有雄鼠并取材检测DFI。两组雄鼠DFI 相比差异具有统计学意义（P= 0.000 ＜0.01），表明造模成功。见表1。

表1 两组雄鼠DFI比较（±s）

表1 两组雄鼠DFI比较（±s）

注：与A组比较，*P ＜0.01。

组别雄性空白对照组（A组）雄性造模组（B组）t值P值DFI（%）4.69±1.48 18.95±4.12**-10.308 0.000 n 10 10

2.3 雌鼠合笼情况比较

与C 组比较，D 组小鼠产仔数（P= 0.000）及活胎数（P= 0.000）均显著降低，死胎率明显增高（P=0.002）；与D 组比较，E 组产仔数（P=0.014）及活胎数（P=0.000）显著增加。但两组死胎数比较，差异无统计学意义。见表2。

表2 各组小鼠合笼情况比较（±s）

表2 各组小鼠合笼情况比较（±s）

注：与C 组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与D 组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01。

死胎数0 1.75±1.39**1.00±1.12*组别C组D组E组n989产仔数9.89±1.90 5.13±2.10**7.56±1.67*△活胎数9.89±1.90 3.38±0.92**6.56±1.13**△△

3 讨论

精子DNA 对于妊娠而言至关重要，虽然许多不育患者的精液分析报告显示精子活力和浓度正常，但是他们中有近一半患者的精子DNA 碎片率增高［15］。因此，精子DNA 更能够反映男性生殖能力，预测妊娠结局。临床治疗中也发现，与无相关病史的男性相比，有反复自然流产史夫妇中的男性，精子的活动率明显较差，DFI增高［16-18］。当精子DFI小于27%时，受精后卵母细胞能够修复受损的精子DNA，但如果DFI超过这一数值，就超过了卵母细胞的修复能力，可能会出现不孕或自然流产［19］。

女性的孕育能力和其后代的健康在很大程度上依赖于源源不断的优质卵母细胞。与体细胞相似，当卵母细胞受到各种内外因素，如辐射、污染、炎症、氧化损伤等影响，出现DNA 损伤后，会启动DNA 损伤修复通路，DNA 修复可能是确保女性生育能力以及将高质量的遗传物质传递给后代的重要机制［20］。卵子在形成时，会经历染色体解螺旋、复制、分离等过程，在这一时期染色体更容易受到外界因素的影响出现DNA 损伤。而且，随着年龄的增大［21］、复制次数的增加以及外界不明原因的影响，会导致染色体出现复制错误、断裂、基因片段丢失等情况，最终导致形成的卵子功能不全，甚至出现过早凋亡，在这期间卵母细胞的DNA 修复机制起着至关重要的作用［22］。然而，这种能力是有限的，可能随着年龄的增长而下降［23］。

目前已经有许多关于中药修复精子DNA 的报道［24］，但未见中药修复卵子DNA 的相关报道。关于中药提高卵子质量方面的报道更为常见，中药能够明显提高卵子的质量，减少促排卵时促性腺激素的使用，提高妊娠率、活产率，改善妊娠结局［25］。在辅助生育技术中，中医药同样也发挥着重要作用，补肾类中药能够改善卵子质量、提高受精率、降低不良反应及流产率，总体提高辅助生育的成功率［26-27］。目前认为卵细胞中线粒体功能与卵子质量密切相关［28］，经典补肾填精中药方剂毓麟珠可通过改善卵巢功能不全模型小鼠的线粒体功能提高卵子质量［29］。也有学者发现采用自拟经后增殖方（组成：党参、白术、茯苓、甘草、熟地黄、白芍、当归、川芎、菟丝子和鹿角霜等）能够提高超促排卵大鼠卵母细胞质量，具体机制可能与提高GDF9、BMP15 和FGF10（分泌因子）的表达有关［30］。

通过临床观察并结合文献发现，许多不孕症女性患者常见的临床证型为肾虚血瘀型，尤其是卵巢功能低下及卵巢早衰患者［31］。众多医家也主要通过补肾活血法改善患者卵巢功能［32-33］。因此，近年来课题组将原本改善男性生殖细胞质量的益肾通络方应用于女性患者，尤其是高龄女性患者，取得了较好的疗效。但中医药是如何通过提高卵母细胞DNA 修复能力从而提高妊娠率的机制尚不明确，本研究为中医药提高卵母细胞DNA 修复能力提供初步证据，但仍需进一步探讨其确切机制。

综上所述，BaP 染毒可造成雄鼠DFI 升高，降低合笼雌鼠妊娠率。益肾通络方提前干预雌鼠可改善其与高DFI雄鼠合笼的妊娠结局。具体机制推测可能与益肾通络方改善卵子的DNA修复能力有关。