MALAT1对神经病理性疼痛大鼠STAT3信号通路的影响

姚 瑶，刘 艳，胡 飞

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是复杂的慢性疼痛病症，由感染、肿瘤、自身免疫等因素引起的外周或中枢神经系统损伤及功能障碍所导致，主要临床表现为炎症区域持续性的自发痛、痛觉过敏和痛觉超敏，常见于脊髓损伤、疱疹病毒感染、癌症化疗及糖尿病病人，严重影响病人生存质量[1-2]。目前，NP患病率为6.9%～10.0%，临床药物干预及物理治疗均效果欠佳，是临床较为难治的神经系统症状之一[3]。而NP的发生机制尚未明确，深入探讨其机制将有助于寻求有效的临床镇痛方案。研究发现，炎症反应在诱发NP的初级损伤、次级损伤过程中起重要作用，其调控成为NP治疗领域的研究热点[4]。信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)是连接炎症反应与癌症的关键信号通路分子，参与多种炎症性疾病的发生发展[5-6]。已有研究发现，STAT3通路在NP的炎症反应调控中扮演重要角色[7]。肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是被证实与非小细胞肺癌有关的第一个长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)，可强化STAT3信号通路，在多种炎症性疾病中发挥重要调节作用[8-9]，但在NP中的作用机制尚缺乏研究。本研究探讨MALAT1对NP大鼠及STAT3信号通路的影响，以期为NP临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SD大鼠，体质量210～250 g，购于上海杰思捷实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2018-0004。饲养条件：昼夜交替(周期为12 h)，自由饮水、进食，温度为22～25 ℃，相对湿度为40%～70%。

1.1.2 主要试剂 MALAT1的慢病毒干扰载体由武汉益普生物科技有限公司构建；RNA提取试剂盒(货号：WLA088b)购自沈阳万类生物科技有限公司；实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)试剂盒(货号：F-430)购自北京美科美生物技术开发有限公司；MALAT1、STAT3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物由上海信帆生物科技有限公司设计合成；大鼠白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)试剂盒、RIPA裂解液(货号：SBJ-R0064、SBJ-R0040、SBJ-R0546、SBJ-0995)购自南京森贝伽生物科技有限公司；磷酸化STAT3(p-STAT3)、STAT3抗体、GAPDH抗体、羊抗兔免疫球蛋白G(货号：ab76315、ab68153、ab181602、ab133470)购自美国Abcam公司。

1.1.3 主要仪器 2390型Electronic Von Fery触觉测痛仪购自美国CST公司；Lightcycler 480 Ⅱ型荧光定量聚合酶链式反应(PCR)仪购自德国Roche公司；MODEL550型酶标仪购自美国Bio-Rad公司；AlphaImager Mini型凝胶成像系统购自美国ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及处理 大鼠适应性喂养1周，进行鞘内置管手术，置管后观察3 d，选取置管成功的大鼠40只，分为对照组、假手术组、NP组、阴性慢病毒组和MALAT1 shRNA组，每组8只。NP组、阴性慢病毒组和MALAT1 shRNA组大鼠建立NP模型[3]：使用1%戊巴比妥钠对大鼠(按0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉，左大腿剪毛，乙醇消毒，切开皮肤，暴露出坐骨神经分支，用4-0丝线结扎胫神经和腓总神经(松紧适中，以不影响神经血液循环、大鼠左后肢微微抽搐为宜)，该过程注意避免损伤其他神经，伤口处撒青霉素粉末预防感染，依次缝合肌肉、皮肤；假手术组仅暴露坐骨神经，不进行结扎，其他手术操作同上；对照组不进行手术。术后MALAT1 shRNA组大鼠鞘内注射30 μL MALAT1慢病毒干扰载体pLenti-CMV-MALAT1-RFP-Puro(1×109U/mL)，阴性慢病毒组注射等量阴性慢病毒干扰载体，对照组、假手术组、NP组注射等量生理盐水。

1.2.2 大鼠行为学测定 于造模前1 d及造模后1 d、7 d、14 d分别采用Von-Frey纤维法、热辐射法测定大鼠的机械性缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和热缩足反射潜伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，以评价大鼠机械痛觉过敏和热痛觉过敏。MWT测定：将大鼠放在透明玻璃笼中(底部为1 cm×1 cm的铁丝网)，用不同力度值的Von-Frey纤维丝刺激大鼠左后足掌心，直至出现缩足、舔足等动作即为阳性，记录力度为痛阈值，初始力度为2 g，出现阳性反应则降低力度继续刺激，反之提升力度继续刺激，重复5次，每次间隔5 min，至少出现3次抬足反应的痛阈值记为MWT。TWL测定：将大鼠放在透明玻璃笼中(底部为1 cm×1 cm的铁丝网)，用热痛刺激仪照射大鼠左后足掌心，记录照射开始至大鼠缩足间的时间，即TWL，均重复测量3次，每次间隔5 min，取均值。

1.2.3 qRT-PCR法检测大鼠脊髓组织中MALAT1、STAT3 mRNA表达情况 造模后14 d，将大鼠断头处死，取脊髓组织，取部分于冰上匀浆，RNA提取试剂盒提取总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，使用qRT-PCR试剂盒配制反应体系，在荧光定量PCR仪上检测MALAT1、STAT3 mRNA表达水平，以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法表示结果。MALAT1正向引物：5′-AAAGCAAGGTCTCCCCACAAG-3′，反向引物：5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA-3′；STAT3正向引物：5′-ATGAGTGTGGCCGTTGCA-3′，反向引物：5′-TGTCCCGGCAGAATTTCC-3′；内参GAPDH正向引物：5′-CCAGGGCTGCCTTCTCTTGT-3′，反向引物：5′-GTGCCGTTGAACTTGCCGTG-3′。

1.2.4 ELISA法检测大鼠脊髓组织中炎症相关因子表达情况 取部分脊髓组织于冰上匀浆，于4 ℃下，20 000×g离心30 min，分离上清液，使用IL-6、TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒检测IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平。

1.2.5 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测大鼠脊髓组织中STAT3通路相关蛋白表达情况 向剩余的脊髓组织加含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰上匀浆，提取总蛋白，BCA法定量，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，脱脂奶粉封闭1 h，依次加一抗(p-STAT3、STAT3抗体、GAPDH抗体，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，加二抗(羊抗兔免疫球蛋白G，1∶1 500)室温孵育1 h，化学发光法显色，扫描图像，分析目的蛋白灰度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠行为学指标检测 造模前1 d，各组大鼠MWT、TWL比较差异均无统计学意义(P>0.05)。造模后1 d、7 d、14 d，对照组与假手术组大鼠MWT、TWL比较差异均无统计学意义(P>0.05)；与假手术组比较，NP组MWT明显降低(P<0.05)，TWL明显缩短(P<0.05)；NP组MWT、TWL与阴性慢病毒组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与阴性慢病毒组比较，MALAT1 shRNA组大鼠MWT明显升高(P<0.05)，TWL明显延长(P<0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠MWT、TWL比较(±s)

2.2 各组大鼠脊髓组织中MALAT1、STAT3 mRNA表达情况 对照组与假手术组大鼠脊髓组织中MALAT1、STAT3 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组比较，NP组大鼠脊髓组织中MALAT1、STAT3 mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；NP组与阴性慢病毒组大鼠脊髓组织中MALAT1、STAT3 mRNA表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与阴性慢病毒组比较，MALAT1 shRNA组大鼠脊髓组织中MALAT1、STAT3 mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。详见表2。

表2 各组大鼠脊髓组织中MALAT1、STAT3 mRNA表达水平比较(±s)

2.3 各组大鼠脊髓组织中炎症相关因子表达情况 对照组与假手术组大鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组比较，NP组大鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平明显升高(P<0.05)；NP组与阴性慢病毒组大鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与阴性慢病毒组比较，MALAT1 shRNA组大鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平明显降低(P<0.05)。详见表3。

表3 各组大鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平比较(±s) 单位：pg/mg

2.4 各组大鼠脊髓组织中STAT3通路相关蛋白表达情况 对照组与假手术组大鼠脊髓组织中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与假手术组比较，NP组大鼠脊髓组织中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.05)；NP组与阴性慢病毒组大鼠脊髓组织中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；与阴性慢病毒组比较，MALAT1 shRNA组大鼠脊髓组织中p-STAT3、STAT3、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。详见图1、表4。

图1 各组大鼠脊髓组织中p-STAT3、STAT3蛋白表达条带图

表4 各组大鼠脊髓组织中p-STAT3、STAT3蛋白表达水平比较(±s)

3 讨 论

NP是临床常见疾病，病因、症状多样，发病机制复杂，临床尚缺乏有效根治的方法，且无法在人体中进行模拟研究[10]。为进一步阐明NP的发病作用机制并寻找缓解NP的方法，本研究采用坐骨神经分支选择性结扎法建立NP大鼠模型，造模后1 d，NP组大鼠较假手术组大鼠MWT明显降低，TWL明显缩短，即大鼠出现机械痛觉过敏及热痛觉过敏，表明模型制备成功。

慢性神经性痛的发生发展是由多个因素相互影响的复杂过程，多重证据表明，炎症通路中的炎症介质可充当疼痛介质，参与NP的病理过程[11]。坐骨神经分支结扎损伤后引起局部组织炎症反应，通过释放内源性物质将外周感受器活化，进而将伤害性刺激传入脊髓组织，导致脊髓组织释放大量炎症介质及致痛因子，参与NP的发生发展[12]。本研究结果亦显示，与假手术组比较，NP组大鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平明显升高，提示炎性因子IL-6、TNF-α、IL-1β参与NP的发生过程。STAT3信号通路是细胞内信号转导的主要媒介，可被多种细胞因子激活，在炎症反应发生发展过程中发挥重要作用[13-14]。杨建梅等[15]研究显示，复方藜芍片改善慢性偏头痛的作用机制可能与阻断大鼠皮层酪氨酸激酶2(JAK2)/STAT3通路，进而抑制神经炎症有关。周瑞等[16]研究表明，鞘内注射MRS2211能明显缓解糖尿病神经痛大鼠热痛敏症状，其作用机制与抑制脊髓背角IL-1β、IL-6表达，进一步抑制JAK2/STAT3通路激活有关。本研究结果显示，与假手术组比较，NP组大鼠脊髓组织中STAT3 mRNA水平及蛋白磷酸化水平均明显升高，提示STAT3通路参与NP的病理进程。MALAT1属于lncRNA，既往在癌症方面多有研究，近年来发现其在多种炎症相关疾病中发挥重要调节作用[8-9]。Wei等[17]研究发现，MALAT1可通过miR-150-5p /核转录因子-κB(NF-κB)轴调节败血症诱导的心脏炎症。Patel等[18]研究表明，创伤性脑损伤后，脂肪干细胞衍生的外泌体中的MALAT1能调节炎症反应，减轻脑皮质损伤。王悦等[19]研究发现，在大鼠肝损伤过程中，MALAT1的高表达与IL-6/STAT3信号通路激活有关。Wang等[20]研究发现，MALAT1能通过上调miR-20b-5p，进而增强STAT3，促进视网膜母细胞瘤发展。本研究显示，与假手术组比较，NP组大鼠脊髓组织中MALAT1 mRNA表达水平明显升高，提示MALAT1的异常升高与NP发生机制有关。本研究通过鞘内注射MALAT1慢病毒干扰载体下调MALAT1在大鼠中的表达，发现大鼠MWT明显升高，TWL明显延长，提示干扰MALAT1表达可缓解NP大鼠的机械痛觉过敏及热痛觉过敏症状。同时，干扰MALAT1表达后，NP大鼠脊髓组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达水平及STAT3 mRNA、蛋白磷酸化水平均明显降低，提示干扰MALAT1表达可抑制NP大鼠脊髓组织炎症反应并抑制STAT3信号通路激活。

综上所述，MALAT1在NP大鼠体内高表达，干扰其表达能抑制NP大鼠体内炎症反应及STAT3信号通路的激活，缓解机械痛觉过敏及热痛觉过敏症状。