壮药白花九里明提取物绿原酸含量测定及对早孕子宫出血模型大鼠心肌细胞的影响

朱智德，杨 宏，蒋志雄，那袭雪，韩 璐，宁小清

壮药白花九里明为菊科艾纳香属植物东风草的干燥地上部分。白花九里明味微苦、性微温，主治流行性感冒、产后失血过多、月经不调等症[1]。广泛分布于我国广西、广东、云南、贵州、四川、湖南南部、江西南部、福建以及台湾等地区[2]。现代研究对白花九里明的研究除妇科止血外，在心血管方面也有研究，王杉等[3]用白花九里明提取液对蟾蜍离体灌流蛙心，结果表明白花九里明不影响心率，低浓度的白花九里明对心肌收缩影响不明显；中浓度、高浓度的白花九里明能降低心肌收缩力，且随药物浓度增大，降低心肌收缩力的效应越明显。钟兴隆等[4]研究表明，白花九里明提取液具有减慢小鼠心率、降低P波和QRS波振幅的作用；王彩冰等[5-6]观察白花九里明提取液对小鼠不同时间段血压和心率影响，结果显示，白花九里明具有降低血压的作用，对心率没有明显影响，其降压作用可能通过减少心搏量和降低外周阻力来实现。熊继宗等[7]的实验研究也表明，白花九里明当用量达到一定浓度时对大鼠有降压作用，而不影响大鼠的心率。陈天等[8]研究表明，白花九里明有改善心肌细胞缺血缺氧、干预氧自由基对心肌细胞损伤、促进心肌细胞修复作用；白花九里明含有对心脏具有保护作用的绿原酸，目前尚未见白花九里明提取物对早孕子宫出血大鼠模型的心肌是否有影响的报道。故本研究拟通过测定提取物中绿原酸含量及观察其对早孕子宫出血大鼠心肌细胞的影响，为白花九里明的进一步研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药材和试剂 白花九里明提取物：白花九里明药材购自广西北流市，提取物采用水提醇沉方法获得。甲醇：分析纯购自国药集团化学试剂有限公司，批号：20180605；色谱纯购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，批号：LOT164787。乙腈色谱纯购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，批号：LOT161387；磷酸色谱纯购自天津市科密欧化学试 剂有限公司，批号：20160007；绿原酸标准品购自中国食品药品检定研究院，批号：110753-201817；米索前列醇片购自湖北葛店人福药业有限责任公司，批号H20073696；米非司酮片购自湖北葛店人福药业有限公司，批号H20033551；水合氯醛购自天津市大茂化学试剂厂，批号302-17-0；羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)购自Ruibio，批号7365-45-9；对硝基苯磷酸二钠(PNPP)购自Ruibio，批号XP7171；磷酸缓冲盐溶液(PBS)购自Solarbio，批号：P1022；无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司，批号：10009218；二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司，批号：10023418；碳酸锂购自国药集团化学试剂有限公司，批号：20022818；冰醋酸购自国药集团化学试剂有限公司，批号：10009218；苏木素购自bioswamp，批号：G1140；伊红购自bioswamp，批号：E8090；中性树脂购自bioswamp，批号：G8590。

1.2 仪器和设备 超纯水机(Q-Gard A2 Mingche，批号：F7CA94750)；优普超纯水机(四川优普超纯科技有限公司，型号：UPK-II-60L)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司，型号：SHB-B95)；中型超声清洗器(德国埃尔玛公司)；Waters Alliance e2695高效液相色谱仪(Waters corporation)；色谱柱(InertSustain®C18 250 nm×4.6 nm，5 μm，购自GL Sciences Inc)；台式多功能冷冻离心机(Centrifuge5430R，Eppendorf)；电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，型号：SQP、METTLER TOLEDO，型号：XS105DU]；光吸收微孔板检测(Tecan Austria GmbH，型号：Infinite M200 PRO)；电热恒温鼓风干燥箱(上海鸿都电子科技有限公司，型号：DHG-9140A)；移液枪[大龙兴创实验仪器(北京)有限公司]；微孔滤膜(天津津腾实验设备有限公司，规格：0.45 μm)；色谱进样瓶(上海安谱科学仪器有限公司，规格：2 mL)；电热恒温鼓风干燥箱 (上海鸿都电子科技有限公司，批号DHG-914OA)；恒温箱 (上海鸿都电子科技有限公司，批号DHG-914OA)；高速冷冻离心机 (上海安亭科学仪器厂制造，批号TG16-WS)；电子分析天平(赛多利斯德国，批号JA1003B)；正置显微镜(徕卡显微系统有限公司，MD1000)；移液器(吉尔森P型移液器公司)； 恒温烘箱 (上海恒一科学仪器有限公司，DHG-9023A)；组织脱水机(湖北康强医疗器械有限公司，TKD-TSB)；石蜡包埋机(湖北泰维科技实业有限公司，TB-718D)；石蜡切片机 (徕卡显微系统有限公司，RM2235)；摊片烤片机(湖北康强医疗器械有限公司，TKD)。

1.3 实验动物 Wistar大鼠120只，体质量(280±20)g，无特定病原体(SPF)级，雌雄各半，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(湘)2016-0011。实验前，动物适应性喂养1周。实验大鼠雌雄分笼饲养，每笼5只，自由饮水，室温20～25 ℃，相对湿度45%～65%。

1.4 壮药白花九里明提取物中绿原酸含量测定

1.4.1 色谱条件

1.4.1.1 流动相观察 分别以乙腈-水(10∶90)、乙腈-0.1%磷酸(10∶90)、甲醇-0.1%磷酸(32∶68)、甲醇-水(32∶68)作为考察的流动相，对白花九里明一种提取物进行流动相的研究。结果显示，白花九里明一种提取物的峰型在流动相为乙腈-0.1%磷酸(10∶90)的条件下较好，且没有出现倒峰、拖尾的现象。故选用乙腈-0.1%磷酸作为白花九里明一种提取物含量测定的流动相。详见图1～图4。

图1 乙腈-0.1%磷酸(10∶90)

图2 乙腈-水(10∶90)

图3 甲醇-0.1%磷酸(32∶68)

图4 甲醇-水(32∶68)

1.4.1.2 流动相比例选择 分析图5和图6可知，在流动相为乙腈-0.1%磷酸(10∶90)的条件下，绿原酸对照品色谱图与白花九里明提取物色谱图比对，提取物中绿原酸的峰未达到分离要求(R>1.5)，所以继续调整比例，至分离度达到要求。分析图7～图10可知，在流动相乙腈-0.1%磷酸(8∶92)的条件下，提取物中绿原酸峰型对称性好，无倒峰、拖尾现象，分离度R>1.5。故选用乙腈-0.1%磷酸(8∶92)作为白花九里明一种提取物中绿原酸含量测定的流动相，绿原酸对照品色谱图见图11，提取物色谱图见图12。

图5 白花九里明提取物色谱图[流动相：乙腈-0.1%磷酸(10∶90)]

图6 绿原酸对照品色谱图[流动相：乙腈-0.1%磷酸(10∶90)]

图7 白花九里明提取物色谱图[流动相：乙腈-0.1%磷酸(15∶85)]

图8 白花九里明提取物色谱图[流动相：乙腈-0.1%磷酸(12∶88)]

图9 白花九里明提取物色谱图[流动相：乙腈-0.1%磷酸(7∶93)]

图10 白花九里明提取物色谱图[流动相：乙腈-0.1%磷酸(8∶92)]

图11 绿原酸对照品色谱图[乙腈-0.1%磷酸(8∶92)]

图12 白花九里明提取物色谱图[乙腈-0.1%磷酸(8∶92)]

1.4.2 绿原酸波长测定的选择 运用酶标仪对绿原酸进行波长扫描，扫描的波长在230～400 nm，结果其吸光度值在波长330 nm处最大，所以，选用330 nm作为白花九里明一种提取物中绿原酸含量测定的检测波长。

1.4.3 提取物中绿原酸含量测定的色谱及检测条件的确定 色谱柱：C18柱(InertSustain®C18 250 nm×4.6 nm，5 μm)，检测波长330 nm。流动相：采用乙腈-0.1%磷酸，流动相比为8∶92，流速1.0 mL/min，柱温25.0 ℃，进样体积10 μL，理论塔板数按绿原酸峰计算不应少于3 000。

1.4.3.1 标准曲线的制备 取绿原酸标准品1.2 mg置于10 mL的容量瓶中，加水定容至刻度，充分摇匀。即得浓度为0.12 mg/mL的绿原酸对照品溶液。0.45 μm微孔滤膜过滤，分别进样2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，绿原酸对照品的进样质量(μg)作为横坐标(x)，峰面积作为纵坐标(y)，绘制出标准曲线(见图13)。并计算出回归方程，y=2 000 000x+6 159.6，R2=0.999 3。绿原酸在0.24～1.20 μg质量范围内与其对应的峰面积呈良好的线性关系(见表1)。

图13 绿原酸对照品标准曲线

表1 绿原酸进样质量与其相对应的峰面积

1.4.3.2 精密度观察 取浓度为0.12 mg/mL的绿原酸对照品溶液，0.45 μm微孔滤膜过滤，按照上述确定的色谱条件连续进样6次，且每次的进样体积均为10 μL。分别测定其峰面积并计算出精密度的相对标准偏差(RSD)。经计算绿原酸峰面积的RSD值为0.72%，表明实验所用的该仪器精密度良好。详见表2。

表2 精密度的实验结果

1.4.3.3 稳定性实验 精密称取白花九里明一种提取物0.1 g，置于10 mL的容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀。0.45 μm微孔滤膜过滤，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定其绿原酸的峰面积，进样体积均为10 μL，并计算峰面积的RSD值。计算出其RSD=1.28%，表明样品溶液稳定性良好。详见表3。

表3 白花九里明提取物中绿原酸的稳定性

1.4.3.4 重复性实验 精密称取白花九里明一种提取物0.1 g，共称6份，分别置于10 mL的容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，作供试品溶液。0.45 μm微孔滤膜过滤，按照上述的色谱条件，测定其绿原酸的峰面积。经计算白花九里明一种提取物中绿原酸的平均含量为4.281 7 mg/g，其RSD=1.80%，表明实验所用的方法具有良好的重复性。详见表4。

表4 重复性的实验结果

1.4.3.5 加样回收实验 精密称取同一白花九里明提取物0.1 g(已知含量为4.281 7 mg/g)，共称6份。分别置于10 mL的容量瓶中，加少量水溶解混匀，每份分别精密加入绿原酸对照品溶液(0.12 mg/mL)3.62 mL，再加水至刻度，充分摇匀，制得样品溶液。0.45 μm微孔滤膜过滤，测定样品溶液中的绿原酸含量，计算加样回收率。经过计算得出平均回收率为97.89%，RSD=1.36%，表明该方法具有良好的回收率。详见表5。

表5 加样回收实验结果

1.4.3.6 白花九里明提取物中绿原酸含量测定 精密称取白花九里明一种提取物3份，每份0.1 g，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，得供试品溶液。0.45 μm微孔滤膜过滤，按色谱条件测定，每份样品进样量为10 μL，测定其峰面积并计算出样品中的绿原酸含量。

1.4.4 大鼠模型心肌组织切片

1.4.4.1 建立产后子宫出血大鼠模型 参考文献[9]的方法按雌性与雄性1∶1比例合笼，次日晨进行阴道涂片实验，在显微镜下观察有精子或阴道栓即为妊娠第1天，选取10只未怀孕大鼠，作为空白对照组，选取怀孕成功大鼠50只，随机分5组，每组10只。即模型组、阳性组、白花九里明高剂量组(9.4 g/kg)、白花九里明中剂量组(4.7 g/kg)、白花九里明低剂量组(2.4 g/kg)。各组分别于妊娠第7天08：00灌胃给药米非司酮溶液(12 mg/kg)和18：00灌胃米索前列醇溶液(120 μg/kg)，造成早孕大鼠的不完全流产子宫出血模型。连续给药至第14天，每日置于大鼠阴道内1个棉球，次日分别在08：00和18：00将棉球取出，密封冷藏保存备用，同时更换新棉球。

1.4.4.2 给药方法 未孕10只为空白组(灌胃生理盐水)，取妊娠大鼠50只，随机分为5组：模型组、阳性对照组(按照人与实验Wistar大鼠剂量换算的咖啡酸片组10 mg/kg)、白花九里明高剂量组(9.4 g/kg)、白花九里明中剂量组(4.7 g/kg)、白花九里明低剂量组(2.4 g/kg)，每组10只。受孕8 d，各组于造模后第8天开始灌胃，每日1次，连续给药7 d。

1.4.4.3 麻醉取血取心脏、切片、图像采集 给药第7天后30 min，用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主动脉取3管血，分别于5 mL普通采血管、2 mL EDTA采血管、2 mL 3.2%枸橼酸钠采血管，备用。手术取心脏，取其一部分心脏组织用 10%甲醛固定，进行常规石蜡包埋切片，苏木精-伊红(HE)染色；光镜下观察。通过显微镜拍照，Lecia Applaction Stiue图像系统采集。

2 结 果

2.1 白花九里明提取物中绿原酸含量 实验测定提取物3份的峰面积并计算出样品中的绿原酸含量分别为4.5233mg/g、4.4224mg/g、4.5092mg/g，平均(4.4850±0.062 5)mg/g。详见表6。

表6 白花九里明提取物绿原酸含量测定结果

2.2 白花九里明提取物对心肌细胞的影响 空白组、模型组、阳性对照组、白花九里明高剂量组、白花九里明中剂量组、白花九里明低剂量组心肌细胞结构清晰，无变性坏死；毛细血管无明显扩张现象。说明提取物对心肌细胞无影响。详见图14。

图14 各组大鼠心肌细胞HE染色图(×100)

3 讨 论

绿原酸是由咖啡酸的羧基和奎尼酸的羟基缩合而成的缩酚酸，是植物细胞通过莽草酸途径合成的一种苯丙素类物质，其分子结构中有酯键、不饱和双键、多亓酚和邻二酚羟基[10-11]。

本实验参考了《中国药典》(2015版)对蒲公英中绿原酸含量测定的条件及方法[12]，通过对绿原酸流动相的优化调整及波观察，最终在检测波长为330 nm、流动相为乙腈-0.1%磷酸(8∶92)，在此条件下，绿原酸在0.24～1.20 μg质量范围内与其对应的峰面积呈良好的线性关系，回归方程为y=2 000000x+6 159.6，R2=0.999 3，平均回收率为97.89%，RSD=1.36%，白花九里明提取物中绿原酸含量为(4.485 0±0.062 5)mg/g。

绿原酸食入后可经小肠分泌物作用，变为无致敏性物质，有止血、增高白细胞及抗病毒作用，具有缩短血凝及出血时间的作用[13]。大部分绿原酸在肠黏膜酯酶作用下被水解为咖啡酸和奎宁酸，随后进入结肠，在肠道菌群的作用下代谢为间香豆素、苯丙酸、苯甲酸和马尿酸，马尿酸主要来源于部分奎宁酸的转化，其他代谢产物主要来源于部分咖啡酸转化，这些微生物源代谢产物占绿原酸摄入量的57.4%，然后在还原酶作用下转化为相应的二氢阿魏酸进入循环[14]。

绿原酸作为一种自由基清除剂和抗氧化剂，可以保护心血管系统。有研究显示，绿原酸能对人的内皮细胞损伤起保护作用，绿原酸可以通过消除抗脂质过氧化和自由基来保护血管内皮细胞，从而预防动脉粥样硬化和高血压等[15]。本研究观察白花九里明对早孕子宫出血大鼠模型心肌细胞的影响，结果显示心肌细胞无明显变化，这是否提示白花九里明提取液中的绿原酸对心脏有一定保护的作用，其机制有待进一步研究。

白花九里明药材含绿原酸、咖啡酸等止血物质，具止血作用[16-17]，白花九里明提取物对子宫平滑肌具有明显的收缩作用[18]，同时对早孕大鼠模型心肌细胞无影响，提示该提取物临床用药对心脏的安全性。