胆道肿瘤复发转移和预后评估新思路：CTCs及FGFR2研究进展

辛培源，杨振宇综述 包国强审校

胆道恶性肿瘤(biliary tract cancers, BTC)约占消化道恶性肿瘤的3%，是起源于胆囊和胆管上皮的恶性肿瘤。根据肿瘤的发生部位，BTC分为胆囊癌(gallbladder carcinoma，GBC)和胆管癌(cholangiocarcinoma，CCA) ；BTC具有恶性程度高、早期诊断困难、易复发转移、预后差等特点，其5年生存率在5%左右[1-2]；其发病隐匿，早期阳性体征不明显，出现症状往往已到疾病中晚期。现阶段临床上常联合非特异性肿瘤标志物CEA、CA19-9 等与增强CT、磁共振等影像学检查进行肿瘤的诊断和分期，但这2种方法特异度及性价比均不高[3]。近年来，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)在肿瘤疾病的早期诊断、监测治疗效果、评估预后等方面逐渐崭露头角，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时监测疗效手段[4-5]。其检测方式相对简便，与传统检查方法相比可早期发现病情变化，更加科学、迅速地评价治疗方案的疗效；且现在临床上已有研究证实，CTCs对多种肿瘤的早期复发有预测功能，成为多种肿瘤的独立预后标志物[6]。CTCs作为一种全新的实时监测肿瘤治疗手段，开辟了临床肿瘤学实时动态监测的新格局,临床前景广阔[7]。因此建立基于“胆道系统恶性肿瘤特异性分子特征”的CTCs液体活检系统，对于提高胆道系统恶性肿瘤患者早期诊断率和预后判断有重要的临床意义。

1 循环肿瘤细胞(CTCs)概述

自19世纪澳大利亚医生Ashworth提出循环肿瘤细胞CTCs的概念以来，临床上对于循环肿瘤细胞研究一直在深入进行。

1.1 CTCs来源与检测 CTCs一般从实体肿瘤(原发灶、转移灶)上脱落，进入外周血液循环[8]。其中大部分肿瘤细胞进入人体外周血参与血液循环后，会被免疫细胞吞噬或发生凋亡，只有少数肿瘤细胞可以躲避机体免疫并逃逸，锚着在身体的其他器官或组织上发展成为转移灶，引起肿瘤的复发与转移[9-10]。这些脱落的肿瘤细胞在血液中十分稀少，平均107个白细胞里含有1个CTCs，这也使得目前大量用于分离CTCs的技术都遵循着“富集”和“探测”的原则。“富集”依赖于细胞自身的物理属性，而“探测”则通过免疫染色和显微镜或通过基于PCR的方法实现。目前在研究中最为成熟的检测CTCs的方法是免疫磁捕获法富集，即半自动CellSearch平台(Janssen Diagnostics，Raritan，NJ，USA)使用涂有上皮细胞黏附分子(EpCAM)的铁磁珠对CTCs进行富集，并根据形态特征、细胞角蛋白阳性表达和缺乏白细胞标志物CD45来分辨CTCs[11-12]。

1.2 CTCs与肿瘤转移 目前循环肿瘤细胞理论、自我种植假说等现有的肿瘤转移相关理论都认为循环肿瘤细胞在肿瘤转移中发挥了重要作用[13]。随着临床上对CTCs的研究不断深入，近年来越来越多的研究发现，大多数恶性肿瘤细胞在脱离肿瘤病灶进入外周血循环的过程中会发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，肿瘤细胞发生EMT后可以促进CTCs产生并且还可提高CTCs的生存率，EMT也可促进CTCs转变成为肿瘤转移灶[14]。研究表明，EMT是肿瘤转移进展过程中重要的环节之一，肿瘤细胞发生EMT是导致肿瘤预后差、耐药性增加及治疗效果降低的重要因素之一，发生EMT的CTCs不仅更容易于从肿瘤组织中分离出来，侵入到毛细血管中，提升自身生存能力和转移潜力，而且还会出现型别的变化，形成上皮型、间质型及上皮—间质混合型等不同类别[15-16]。有研究发现，CTCs不仅在外周血中以单个细胞存在，还会以细胞团(CTM)形式存在。间质型CTCs和CTM具有更强的转移潜能，更容易在外周血液循环中存活，引发肿瘤的复发与转移[17]。可见，了解CTCs不同型别及其变化情况，对于指导肿瘤临床治疗至关重要。

1.3 CTCs与肿瘤预后 目前关于CTCs与胆道肿瘤新辅助化疗疗效相关性的报道较少。2017 年，Awasthi等[18]对CTCs在胆囊癌中的作用机制进行研究，在27例胆囊癌患者中，有25例在外周血中发现CTCs。研究中提到，利用CTCs计数在1的分界点来明确CTCs与胆囊癌的敏感度、特异度和诊断准确性，其结果分别为 92.6%、91.7%和 92.3%。CTCs计数水平与已知预后指标的临床病理参数显著相关，在>4 的分界点具有显著的诊断潜力，可区分疾病分期Ⅰ、Ⅱ 期和 Ⅲ、Ⅳ期 GBC。以>6为分界点可以鉴别转移性和非转移性的 GBCs，其敏感度、特异度和诊断准确性为 55.6%、100.0%和 85.2%。Sun等[19]对壶腹部癌的 CTCs展开相关研究，62 例样本中 43 例(69.4%)每 3.2 ml全血可检测到大于2个 CTCs，其中 16 例(25.8%)可检测到大于5个CTCs。以每3.2 ml全血2个CTC为界值，检测敏感度为69.4%、特异度为95.8%，且与较短的无进展生存时间(PFS)相关。吴孟超团队研究发现，胆道恶性肿瘤患者外周血CTCs相比于良性疾病患者计数显著升高，阳性率增加，恶性胆道肿瘤的分期与外周血CTCs呈正相关[20]。而吴睿等[21]研究发现，术前CTCs技术作为一种诊断指标在区分胆道恶性肿瘤疾病时，具有更高的诊断价值，可作为传统肿瘤标志物的辅助参考依据。温志坚[22]研究发现，CTCs是胆囊癌诊断、病情监控和预后监测的重要指标，在胆囊癌的临床诊治中具有较大的研究和应用价值。Liu等[23]研究发现，基于CTCs的潜在临床价值通过组合 CD45、DAPI 和 CEP8-FISH 进行检测染色，CTC水平被证明与胆道壶腹肿瘤发展程度有关。Catenacci等[24]发现从胰胆管的入口采取静脉血监测其中CTC的数值，此技术可用于研究胰胆管肿瘤的发病机制和进展，协助诊断或预测，以分析癌症复发或发展转移的风险。Leelawat等[25]在研究中发现血液中CTCs为预测晚期恶性胆道阻塞患者的整体生存提供了有价值的标志。CTCs在胆道系统恶性肿瘤转移过程中发挥重要的作用，CTCs的计数、分子分型和分子特性的相关检测对于胆道系统恶性肿瘤的早期诊断、监测治疗效果、评判复发转移等有着重要的指导意义。

2 成纤维细胞生长因子受体(FGFR)

2.1 FGFR2的生物特性 成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor，FGFR)是一种跨膜酪氨酸激酶受体,通过与成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors，FGFs)结合参与体内多种生理过程并发挥重要作用，其包括4种类型，即FGFR1～4，并在人体细胞中广泛存在，参与机体的各种生化反应，如胚胎发育过程中器官的生成，组织的修复和再生等[26]。 FGFs在新陈代谢、胆汁酸和矿物质—磷酸盐稳态、调节细胞周期的分化、增殖和存活、调节组织纤维化、缺血性损伤后的心脏保护和上皮/伤口修复中都发挥着重要作用[27]。

2.2 FGFR与肿瘤发生的关系 FGFR在各种代谢及细胞生长、增殖和凋亡途径中发挥作用，研究发现FGF-FGFR信号中的任何异常都可能导致肿瘤的发生[28-30]。FGF配体和FGF受体在硫酸肝素蛋白多糖的激活下，形成FGF-FGFR二聚体。FGF-FGFR二聚体复合物激活下游酪氨酸激酶通路，导致蛋白激酶C磷酸化。引起PI3K-Akt/蛋白激酶B通路、JAK/ STAT通路、RAS-MAPK-ERK通路及其他转录调节因子的激活[31]。而细胞的增殖、凋亡等过程都与上述通路密切相关。因此，FGF-FGFR轴发生异常时则可通过影响细胞的存活/凋亡、增殖、迁移和血管生成过程，进而导致肿瘤的发生。其致癌机制大致可归因于染色体易位引起FGFR自身二聚化和激活、FGFs与促进血管生成的血管内皮生长因子(VEGFs)相互作用和染色体畸变导致配体依赖和独立的肿瘤形成和增殖三方面[32]。Molotkov等[33]研究指出，基因突变、重排或移位造成的FGFR2信号通路的改变在多种癌症的发生发展过程中均发挥着重要的作用。基因组学研究也提示，在胆管癌内常见FGFR2融合，包括FGFR2-BICC1，FGFR2-AHCYL1，FGFR2-TACC3等[34]。可见，FGFR2在胆道恶性肿瘤的发生中起着极为重要的作用，因此将其作为新的治疗靶点，是值得尝试的新方向。

2.3 以FGFR2为靶点的治疗现状 随着新的高通量分子生物学检测方法的发展，临床上已经可以针对胆管癌中一些有效的基因治疗靶点做出相关鉴定。有研究发现，特定的基因靶向治疗药物可有效地提升FGFR2基因表达异常胆管癌患者的预后[35-36]。2020年FDA数据显示，FGFR2基因融合在胆管癌患者的发生率为9%～14%。在特定的胆管组织来源肿瘤中，这一比例甚至更高，在部分临床研究中发现在肝内胆管癌患者中，FGFR2基因融合/易位的发生率显著升高[30, 37]。而在治疗上，有研究发现某些靶向药物，如BGJ398对存在FGFR2融合的胆管癌患者具有明确疗效[38]。Wahiduzzaman等[39]研究发现，在促进胆管癌细胞FGFR2基因过表达后48 h，细胞增殖能力较未做处理的对照组相比明显增加，说明FGFR2基因表达具有促进胆管癌细胞增殖的作用。这些研究提示，FGFR2具有促进肿瘤细胞增殖的能力，在胆道系统恶性肿瘤的发生、转移中也扮演着重要的角色。FGFR2的表达程度也与患者的预后紧密相关[40-41]。

研究表明，肝内胆管癌可能携带突变的异柠檬酸脱氢酶基因(IDH1、IDH2)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR1、FGFR2、FGFR3)、Eph受体2(EPHA2)和BAP1(参与染色质重塑的基因)，而且在肝内胆管癌的病例中ARID1B、ELF3、PBRM1、cAMP依赖蛋白激酶A和蛋白激酶B的基因突变发生率更高。但是基因组研究表明，FGFR2畸变与约15%的肝内胆管癌有关，与肝内胆管癌的相关性更高[42]。有文献指出3%～7%的胶质细胞瘤、3%～6%的膀胱癌与FGFR的基因畸变相关。在小鼠模型中，诱导FGFR3的基因改变可以加速胶质瘤样肿瘤的进展[43]。而FGFR2基因的过表达已在约有13.6%的病例中被证实与肝内胆管癌相关[44]。现阶段基于FGFR基因的研究是临床上各领域研究的热点，相关实验与文献报道日新月异，但其真实性、有效性仍有待临床上进一步探究论证。

3 CTCs联合FGFR2与肿瘤疗效监测及预后预测

特异性基因检测已经是癌症病理检测的重要组成部分。但现有基因检测大多针对肿瘤病灶聚合的细胞，将正常组织细胞与肿瘤细胞区别是当前基因检测的一大难点。即便NCCN要求所有需要做基因检测的组织标本均应该先做常规病理检查和HE染色以防止参杂正常组织细胞，仍然难以保证基因检测样本的纯洁性[45]。

同时，有研究发现CTCs发生肿瘤上皮间质转化(EMT)后，其基因表达相对于肿瘤组织细胞会发生显著改变，因此寻找CTCs各项基因表达水平和肿瘤细胞增殖的联系有着重要的意义。其中，多个临床研究发现FGFR2基因的过表达可提升肿瘤细胞的增殖、迁移的几率，同时CTCs细胞又与肿瘤的侵袭性密切相关。CTCs在肿瘤血行转移、淋巴道转移的各个理论机制中均发挥重要作用。越来越多的研究表明，肿瘤细胞发生上皮间质转化后生存、转移、侵袭和耐药能力均会增强，而FGFR2表达增加可能是其重要的原因。因此FGFR作为促进肿瘤细胞增殖的关键因子，其基因在CTC细胞的过表达可能是胆道系统恶性肿瘤转移的关键原因。CTC细胞上FGFR2的基因检测有着为肿瘤转移及基因治疗揭示新的突破口的重要意义。

综上所述，FGFR2基因的过表达具有促进正常细胞和人胆道肿瘤细胞增殖的作用。但是目前对于FGFR2的研究主要集中在组织样本中，对血液中CTC细胞上的FGFR2过表达的研究较为缺乏，这些研究有望进一步揭示胆道肿瘤远处转移的机制。

4 小结与展望

近年来，随着对 CTCs检测技术不断更新，CTCs对肿瘤患者的临床应用价值受到高度重视。综述发现CTCs可作为胆道肿瘤不良预后的预测因子，而且FGFR2基因与胆道肿瘤的不良预后及胆道肿瘤的微转移有密切的联系，目前针对 CTCs和FGFR2与胆道肿瘤预后相关研究较少，但具有广阔的临床研究前景。得益于纳米技术和多重RNA原位分析技术及单细胞测序技术的广泛应用，临床上实现了外周血中各类CTCs的检测、分离。CTCs和FGFR2基因的检测可成为胆道系统肿瘤免疫治疗的新方向，从而指导抗癌药的研发，改善患者的预后。CTCs及其FGFR2基因的检测将会给临床医生对胆道系统恶性肿瘤患者的早期诊断、病情和疗效的监测评估及预后预测提供有价值的指标，然而在其应用于临床前，仍需要进行多中心、多变量、多领域的大型研究作为理论支撑。