生物炭、三叶草和蚯蚓种养对西瓜根际土壤细菌群落多样性的影响

张文文，杨海波，马 玲，安明远，申佳丽，曹云娥

(宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021)

近年来设施西瓜普遍出现过度施用化肥、农药及高复种指数等现象，由此导致了土壤肥力下降、连作障碍及生态功能退化等一系列问题[1-2]，严重地制约了我国设施西瓜产业的可持续发展。

生物炭有较大的比表面积、丰富的化学官能团和较强的离子交换能力，从而具有高效的土壤改良作用[3]。隋阳辉等[4]发现高施量生物炭可有效促进土壤养分固持，低施量生物炭可显著提高玉米单株干物质积累。李大伟等[5]研究表明土壤添加生物碳可显著提高番茄产量和氮素利用率。有研究证明，覆盖白三叶草能够有效减少氮肥的投入、改善土壤的微生态环境并抑制田间杂草生长[6-7]。李青梅等[8]研究表明，覆盖白三叶有利于增加土壤微生物多样性并提高土壤有机质和碳氮含量。作为“土壤改良工程师”，蚯蚓具有提高作物品质、调控土壤生物群落、增加土壤肥力、调节土壤pH及改变化感物质组成等作用,为缓解设施土壤连作障碍提供了可行性[9-10]。目前利用蚯蚓开展连作障碍改良的研究主要是采用蚯蚓堆肥,曹云娥等[11]从蚯蚓堆肥中筛选获得的生防菌暹罗芽孢杆菌可有效抑制瓜类枯萎病并具有防病促生能力。Zhao等[12]研究发现，添加蚯蚓堆肥可以显著提高土壤细菌多样性，同时可降解因连作积累的酚酸类自毒物质。另外，有研究表明蚯蚓堆肥可显著改善土壤质量，从而提高植株的抗性[13]。然而，“作物-蚯蚓”种养模式对连作障碍土壤影响的研究鲜有报道。

本研究从土壤微生态角度出发,探究生物炭、三叶草与“西瓜-蚯蚓”种养模式对根际土壤细菌群落结构和土壤理化性质的影响，结合PICRUSt分析预测挖掘新的功能类群，旨在确定更加合理的设施种植模式,为解决设施西瓜连作土壤改良提供思路和借鉴。

1 材料与方法

1.1 研究地区概况

试验于2021年3月17日至6月21日在宁夏银川贺兰园艺产业园(106.33°E,38.58°N)日光温室内进行，温室长80 m、跨度8 m、高4 m,东西走向。供试土壤类型为砂壤土，pH值7.67,电导率0.89 mS·cm-1，全氮含量0.15 g·kg-1，有效磷含量11.15 mg·kg-1，速效氮含量13.83 mg·kg-1，速效钾含量523.67 mg·kg-1。

1.2 供试材料与试验设计

供试西瓜品种为‘惠玲’，供试蚯蚓为‘赤子爱胜蚓(Eiseniafoetida)’，购买于宁夏万辉生物环保科技有限公司，三叶草为‘白三叶(TrifoliumrepensL.)’，生物炭购买于上海海诺炭业有限公司。

设施蚯蚓种养结合是本课题组经长期研究提出的一种新型且有效的栽培模式：两条垄规格为0.4 m×7.0 m(宽×长)。一垄作为养殖垄，用腐熟1个月后的牛粪作为蚯蚓培育垄，蚯蚓投放量为1 670 kg·hm-2，垄上布置2条滴灌管，滴头间距0.3 m，每日滴水，使养殖垄的湿度达到 55%；另一垄作为栽培垄，将蚯蚓消解牲畜粪便及蔬菜秸秆产生的蚯蚓粪作为西瓜栽培基质，每茬拉秧结束后，种植垄与养殖垄互换，蚯蚓随滴灌带水源切换移动到另一垄，蚯蚓不再继续投放。覆盖三叶草：西瓜定植两周后用水管洒湿空地，平整土地后，将称重后的种子进行洒施，然后耙盖上土壤。

试验采用单因素随机区组设计，共设置8个处理，每个处理3个重复，具体处理如表1所示。

表1 试验设计Table 1 Experimental design

1.3 土壤样品采集与理化指标测定

在西瓜拉秧期采用五点取样法，在每个处理中随机选择5株，将西瓜连根拔起后，抖落根际土壤，剔除杂物后混合制样，每个处理取2份。一份置于室内自然风干，用于测定土壤理化性质，另一份装入10 mL离心管内置于液氮中保存，用于测定土壤微生物。

用电导率仪测定电导率 (水∶土=5∶1，质量比，下同)；用酸度计测定pH，用凯氏定氮仪测定土壤全氮含量；用等离子体发射光谱仪测定土壤全磷、全钾、速效磷和速效钾含量；用重铬酸钾容量法测定有机质含量[14]。

1.4 微生物高通量测序

根据QIAampDNAMiniKit(QIAGENN.V.，德国)说明书对土壤微生物群落总DNA 进行提取，DNA浓度和纯度利用Nano Drop 2000进行检测，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)扩增细菌16SrRNA V3-V4区段。采用IlluminaMiseqPE300测序平台对PCR扩增产物进行测序。

使用美吉生物云平台对测序数据进行质控，使用FLASH 1.2.7软件进行拼接。使用UPARSE软件，质控后的序列进行 OTU 聚类并剔除嵌合体，OTU相似度设置为97%。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库，设置比对阈值为70%[15]。为了预测微生物群落的代谢功能，使用PICRUSt从16S rRNA数据生成功能图谱。

1.5 数据分析

采用Excel 2010进行数据整理及表格制作，采用SPSS 24.0软件进行显著性(P<0.05)检验，利用QIIMEI 1.80软件进行α多样性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理土壤根际化学性质

由表2看出。CK处理土壤pH最高(7.99)，电导率最低(0.61 mS·cm-1)。BT处理有机质含量最高(124.34 g·kg-1)，CK处理有机质含量最低(65.76 g·kg-1)，CK比BT处理有机质含量降低了89.08%；T处理与V处理速效氮含量无显著差异且高于其他处理；BTV处理土壤速效磷含量最高，BT处理次之。BV处理速效钾含量显著高于其他处理；TV处理土壤全氮含量最高(0.79 g·kg-1)，较CK处理高75.56%。

2.2 不同处理根际土壤细菌多样性指数

不同处理模式细菌多样性指数如表3所示，除TV处理外，其他处理间Shannon指数无显著差异，BV处理的Chao1指数显著高于除B处理之外的其他处理，涨幅为2.06%～9.00%。表明添加生物炭后物种丰富度明显提高。除了B处理为96.97%，其他处理土壤样本覆盖度差异较小,平均值均在97%以上,说明西瓜根际土壤样本微生物文库覆盖度高。

表2 不同处理土壤化学性质Table 2 Soil chemical properties under different treatments

表3 不同处理根际土壤细菌的Alpha多样性分析Table 3 Alpha diversity analysis of rhizosphere soil bacteria under different treatments

2.3 不同处理土壤细菌DNA测序分析

依据物种Venn图分析各处理根际土壤样品测得的总OTU数目为7910个(如图1)，其中共有的OTU数为2 315个，约占总数的29.27%。V处理独有的OTU数目最多，为131个，约占1.71 %；CK处理独有OTU数目最少，为73个，约占0.09%；处理B、T、BV、TV、BT和BVT特有的OTU数分别为107、107、128、114、95和101个，分别约占总数目的1.14%、1.14%、1.37%、1.22%、1.01%和1.07%。

2.4 不同处理根际土壤细菌群落结构及优势物种差异

通过数据库对比对不同处理的土壤细菌进行分类水平注释，一共得到了45门、156纲、376目、608科、1 211属和2 553种。构建门水平分类细菌的群落结构如图 2所示，在不同处理中占主要优势的菌门有变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、绿弯菌门 (Chloroflexl)、厚壁菌门(Firmicutes)和酸杆菌门(Acidobacteriota)，其它相对丰度大于1%的主要菌门有芽单孢菌门(Gemmatimonadota)、拟杆菌门 (Bacteroidota)和髌骨细菌门(Patescibacteria)。结果表明，不同处理并没有改变细菌门水平上的主要组成，但提高了变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门等的相对丰度，其中BTV处理的变形菌门、放线菌门、厚壁菌门的丰度值分别较CK增加47.85%、30.47%、27.15%，酸杆菌门较CK降低了48.36%。

采用主成分分析法对西瓜根际土壤细菌群落组成进行分析可知(图3)，PC1轴和PC2轴对西瓜根际土壤样本组成差异的贡献值分别为36.31%和17.12%，两者共解释53.43%。PC1可将BTV处理与其他处理相隔开来，说明BTV处理的菌群组成与其他处理相比有明显不同，并且CK、T、BT与V的处理散点距离极近，表明上述4个处理的菌群组成非常相近。而PC2可将BV、TV处理与其他处理相隔开来，说明BV、TV处理的菌群组成与其他处理也存在较大差异。

通过构建进化分支图对不同处理利用组间差异显著影响的物种进行分析(LDA阈值3.5)(图4，见180页)。结果表明，门、纲、目、科和属分类水平中，不同处理中都存在显著优势物种。门水平分类中，CK处理的鞘脂单胞菌门(Gemmatimonadota)，TV处理的放线菌门(Actinobacteriota)和厚壁菌门(Firmicutes)，BV处理的放线菌门(Actinobacteriota)与BTV处理的变形菌门(Proteobacteria)均为各处理的显著性优势菌门。纲水平分类中，T处理的脱卤球菌纲(Dehalococcoidia)，V处理的厌氧绳菌纲(Anaerolineae)和绿弯菌纲(Chloroflexia)，TV处理的芽孢杆菌纲(Bacilli)和拟杆菌纲(Bacteroidia)，BT处理的(Vicinamibacteria)和酸微菌纲(Acidimicrobiia)与BTV处理的放线菌纲(Actinobacteria)和γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)均为显著优势纲。目水平分类中，V处理的热微菌目(Thermomicrobiales)，TV处理的芽孢菌目(Bacillales)、假诺卡氏菌目(Pseudonocardiales)与链霉菌目(Streptomycetales)，BTV处理的棒状杆菌目(Corynebacteriales)、微球菌目(Micrococcales)、假单孢菌目(Pseudomonadales)、鞘脂单胞菌目(Sphingomonadales)与伯克氏菌目(Burkholderiales)均为显著优势目。科水平分类中，T处理的放线菌科(Actinomarinales)，TV处理的芽孢杆菌科(Bacillaceae)、假诺卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)与链霉菌科(Streptomycetaceae)，BT处理的链霉菌科(Streptomycetaceae)，BTV处理的假诺卡氏菌科(Pseudomonadaceae)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)与微球菌科(Micrococcaceae)均为显著优势科。属水平分类中，V处理的鞘脂单胞菌属(Sphingomona)，TV处理的芽孢杆菌属(Bacillus)，BT处理的Vicinamibacteraceae，BTV处理的红球菌属(Rhodococcus)与假单胞属(Pseudomonas)均为显著优势属。

2.5 功能预测分析

采用PICRUSt 2对细菌16s扩增子测序数据进行功能预测分析(表4，见181页)。结果发现，基于KEGG数据库进行比对注释，不同处理土壤样品中6类重要的一级生物代谢通路细菌相对丰度差异显著。BTV较BV处理显著增加了新陈代谢通路细菌的相对丰度，TV较V处理显著增加了遗传信息处理、环境信息处理及生物体系统通路细菌的相对丰度，TV较T处理显著增加了人类疾病通路细菌的相对丰度，BV较V处理显著增加了细胞过程通路细菌的相对丰度。

针对不同土壤处理细菌基因二级功能层进行预测分析。如图 5所示(见 181页)，各处理土壤微生物群落均有全局概览通路、碳水化合物代谢、辅助因子和维生素代谢、能量代谢、膜运输、氨基酸代谢、细胞运动、翻译、传染病、细菌、内分泌系统等46个子功能，其中全局概览通路(40.22%～40.73%)、碳水化合物代谢(9.14%～9.33%)、辅助因子和维生素代谢(8.13%～8.29%)为主要子功能。具体而言，BTV处理的碳水化合物代谢、能量代谢、膜运输、氨基酸代谢、核苷酸代谢、运输和分解代谢等38个二级功能预测基因拷贝数最多，V处理的多糖生物合成和代谢的预测基因拷贝数最多，B处理的感官系统的预测基因拷贝数最多，TV处理的翻译的预测基因拷贝数最多。

图1 不同处理土壤细菌OTU分布Venn图Fig.1 Venn diagram illustrating OTU distribution of bacteria of different soil

图2 不同处理土壤门水平上物种相对丰度分布Fig.2 Relative read abundance of rhizobacteria community structures at the phylum level in different samples

图3 不同处理土壤细菌群落结构分析Fig.3 Analysis of soil bacterial community structure in different land use types

3 讨 论

本研究表明，生物炭、三叶草和蚯蚓种养施用于土壤后，土壤pH值显著降低。尤其是添加三叶草后，土壤pH降为7.72，分析认为与三叶草促进了土壤有机酸和腐殖酸的形成，进而导致土壤pH降低[16]；各处理土壤电导率均显著增加，原因可能是与生物炭和三叶草本身含有较多的可溶性盐或与有机质分解释放的盐分有关。生物炭、三叶草及蚯蚓种养可显著增加土壤养分，其中，BTV处理土壤有机质和速效磷含量显著提高，BV处理土壤速效钾含量显著提高。刘爽等[17]研究表明，玉米-鹅种养模式下土壤速效磷、速效钾与有机质含量分别提高了368.78%、92.19%和39.34%。邱海燕[18]研究结果表明，生物炭表面含有碱性基团，能够改善土壤酸碱环境，土壤速效氮、磷、钾也会随之增加。生物炭可改善土壤肥力，增强其对有机质的吸附能力，从而提升土壤有机质含量[19]，这些试验都与本试验的结果相一致。TV处理土壤全氮含量较CK处理增加了75.56%，分析认为有以下两方面原因：(1)蚯蚓对有机质的分解使得物料总量减少，导致全氮含量的相对增加，(2)白三叶草具有固氮作用，可提高土壤含氮量[20]。

图4 不同处理细菌群落分布Fig.4 Taxon with statistical differences between different bacterial communities

表4 土壤细菌群落的一级功能代谢通路在不同处理中的相对丰度信息Table 4 Variations in composition of soil bacterial functional communities in the different use types

图5 不同处理土壤样品预测功能基因二级功能层热图Fig.5 Heat map of predicted functional profiles predicted for different plants (hierarchy level 2)

生物炭、三叶草与蚯蚓种养改变了土壤的营养环境，从而影响根际土壤细菌群落的多样性[21]。本研究发现，含有蚯蚓处理的Shannon和Simpson指数均显著增加，主要原因可能是蚯蚓活动及其分泌物较多，促进了细菌生长和繁殖，从而增加土壤细菌多样性，这与石琪晗等[22]的研究结果一致。B处理细菌Ace和Chao1指数显著高于其他处理，这与郭振等[23]的研究结果一致。已有研究表明，生物炭可缓解土壤细菌与作物两者对营养元素的竞争关系，从而促进了细菌数量生长与繁殖[24]。本研究表明，施用不同添加物后并没有改变门水平上的细菌主要组成，但提高了变形菌门、放线菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门等的相对丰度。V、BV、TV、BTV处理的变形菌门的相对丰度显著升高，而厚壁菌门的相对丰度下降。放线菌门主要降解纤维素以及芳香族化合物，对于土壤的矿化起十分重要的作用。变形菌门和放线菌门都是土壤中的有益菌门，在作物中可促进对氮的吸收[25]；另外，酸杆菌属嗜酸性细菌门，适宜生长于可溶性有机碳含量较低的酸性土壤中[26]。

以往研究关于设施土壤细菌群落的高通量测序分析各处理，主要集中于细菌群落结构，对其功能的研究开展较少。本研究通过PICRUSt功能预测发现，一级功能层预测基因拷贝数整体趋势为TV>BV>BTV>V>BT>T>B>CK。在不同处理模式下的西瓜土壤细菌群落均涉及到了六类一级代谢功能通路，其中新陈代谢功能的相对丰度均大于78%，这说明新陈代谢通路在细菌群落中极为重要，这与刘坤和等[27]的研究结果基本一致。BTV处理的新陈代谢功能显著的高于其它处理，这可能与“生物炭—三叶草—蚯蚓种养—西瓜”的复合生境有关。BV、TV处理中丰度较高的有细胞过程和环境信息处理这两类功能基因，说明施入生物质炭后，土壤细菌具有选择性，土壤细菌功能转向代谢方向，从而调节对土壤有机质的保存能力。各处理二级功能层预测基因拷贝数整体趋势为BTV>BV >V>BT>TV>T>B>CK，其中涉及到相对丰度>1%的通路有 18 类，其中全局概览通路、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅酶维生素代谢和能量代谢为主要功能通路。碳水化合物代谢与土壤中溶磷和固氮有关，利于作物的磷、氮循环[28]。辅酶维生素和能量代谢功能均与细菌固碳和光合作用有关[29]。氨基酸代谢有助于细菌对氨基酸的利用及微生物的繁殖[30]。BTV、BV处理中氨基酸代谢功能显著高于其它处理，表明蚯蚓种养方式改善了土壤理化性质，有效地促进了土壤微生物生长。目前PICRUSt2功能预测着重于菌群功能进行分析，且具有十分强大的应用性，但其预测范围有较大的局限性，后续研究中需要与荧光原位杂交技术和宏基因组技术相结合进一步阐明生物炭、三叶草与蚯蚓种养对细菌群落功能差异的影响。

4 结 论

(1)添加生物炭有助于增加土壤有机质含量，较CK提高了76.41%。三叶草的添加有助于提高壤速效氮、全氮含量，分别提高55.82%、66.67%。蚯蚓种养模式能够提高土壤速效养分。生物炭、三叶草配合蚯蚓种养有利于提高土壤养分，同时可以显著降低土壤pH值，达到改良碱性土壤的效果。

(2)BTV处理的Shannon指数最高，BT处理的Simpson指数较T处理高出56.52%，而B处理Ace、Chao1指数均最高。

(3)不同土壤处理并没有改变细菌门水平上的主要组成，但提高了变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门等的相对丰度，其中BTV处理的变形菌门、放线菌门、厚壁菌门的丰度值分别较CK增加47.85%、30.47%、27.15%，酸杆菌门较CK降低了48.36%。

(4)PICRUSt功能分析预测表明，在不同土壤处理模式下的土壤细菌群落均涉及到了6类一级代谢功能通路与48类二级功能代谢通路，其中BTV处理的新陈代谢功能和氨基酸代谢功能显著高于其它处理，BV和TV处理的细胞过程和环境信息处理功能基因丰度显著增加。

综上所述，从改善连作土壤养分与提高细菌群落多样性的角度来看，生物炭、三叶草配合蚯蚓种养的综合效果优于其他处理。