饲料外源蛋白酶对大口黑鲈生长、饲料利用、体成分和肝脏、肠组织结构的影响

吴建军，张蕉南，宋雪荣，周 樱，刘 伟

(1.武汉新华扬生物股份有限公司，武汉430074；2.福建省特种水产配合饲料重点实验室(福建天马科技集团股份有限公司)，福州350308；3.中国水产科学研究院长江水产研究所，武汉430223)

大口黑鲈(Micropterussalmoides)，俗称加州鲈，因肉质鲜美和营养价值高，已成为我国主要养殖的名优水产鱼类之一[1]。近年来，随着养殖规模的扩大和环保要求的提升，大口黑鲈的饲养方式由投喂冰鲜鱼逐步转换到使用配合饲料[2]。蛋白质是水产动物饲料中最重要[3]且成本最高的成分[4]，其中，鱼粉是鱼类饲料中最主要的优质蛋白质来源[5]。为确保大口黑鲈的生长速度并保障其健康水平，配合饲料中蛋白质含量应接近50%，甚至更高[6]，而且鱼粉的添加比例也高达50%以上[7]。但随着全球养殖业的发展，作为特种水产动物最优质蛋白原料的鱼粉的需要量不断增加，因资源受限导致其价格持续高位运行[8]；另一方面，鱼类对饲料原料的蛋白质并不能完全消化吸收[9]。因此，为改善鱼粉利用率，增加蛋白质消化，有必要研究提高大口黑鲈饲料中蛋白质的利用技术。

利用外源酶是现代养殖业提高饲料养分利用、降低饲料成本最广泛的策略之一[10]。其中，蛋白酶在饲料中的应用研究得到了较多的关注。不同饲料原料组成各异，即使同种原料也会因产地、生产季节、批次等不同，导致产品组成有所差别，而蛋白酶的应用可提高机体对饲料原料蛋白质的利用，降低动物因摄食饲料原料组成不同所导致的影响[11]。对虹鳟(Oncorhynchusmykiss)饲料原料的研究发现，蛋白酶可以显著改善鱼体对鱼粉、羽毛粉等原料的消化吸收，尤其对豆粕的作用最为显著[12]；对鲱(Seriolaquinqueradiata)的研究也发现，低温养殖期间，原料用蛋白酶处理后，鱼体可以显著提高鱼粉等的利用[13]。

然而，大多水产动物配合饲料中蛋白酶的应用研究报道集中在鱼粉替代后，蛋白酶可以提高低鱼粉饲料的整体营养价值[14]，如在低鱼粉饲料中添加蛋白酶可以改善鲫(Carassiusauratusgibelio)生长[15]；棉粕替代鱼粉后使用蛋白酶可以改善尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的生长和健康[16]；在大口黑鲈中，棉籽浓缩蛋白替代40%鱼粉并加入适量蛋白酶后，虽未改善生长，但可以减少鱼体和肝脏脂质积累[17]。目前，饲料中直接添加蛋白酶对鱼类影响的研究较少。因此，本研究以大口黑鲈为研究对象，在实用配方中直接添加不同水平的蛋白酶配制饲料，饲养大口黑鲈，探讨外源蛋白酶水平对其生长性能、饲料利用、体成分、肝脏和肠道组织结构以及部分生理生化指标的影响，以期为蛋白酶在鱼类饲料中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

以鱼粉、鸡肉粉、豆粕等为原料，设计适合大口黑鲈生长的粗蛋白质水平为55%，粗脂肪水平为12%[18]的5组等氮等能配合饲料。其中，蛋白酶的水平分别为0(P0)、10(P10)、20(P20)、40(P40)和80 U/g(P80)，试验配方见表1。饲料配制前先将各种固体原料粉碎，过60目筛，称重后充分混匀。其中，以米糠为稀释剂将蛋白酶预混料逐级混匀。固体原料混合均匀后，加入混合充分的鱼油和大豆油，搅拌均匀后，加入总重30%的自来水，再次搅拌均匀，随后利用小型饲料制粒机(洋工TSE65型双螺杆干法膨化机，北京现代洋工机械公司)，温度小于70 ℃制粒，制成直径为2 mm的成品饲料，自然风干后置于-20 ℃冰箱中储藏备用。

表1 试验饲料配方与营养成分

1.2 试验鱼

试验鱼为大口黑鲈(优鲈3号)，来源于湖北荆州某大口黑鲈专业培苗场。试验鱼运回后，暂养于养殖缸中，暂养期间投喂P0组饲料，使试验鱼适应试验饲料和养殖系统。每天于8:30和16:30投喂2次，表观饱食投喂。

1.3 试验设计和饲养管理

暂养2周后，挑选大小均匀的试验鱼225尾，平均体重(32.93±0.18)g，随机放入15个直径0.9 m，高0.7 m的圆柱形玻璃钢桶内(有效体积为285L)，每桶15尾。每组饲料随机投喂3个养殖桶，每天投喂2次(8:30和16:30)，表观饱食投喂，投喂完毕后立即记录残饵数，随后清除桶内残饵和粪便，并补充养殖水。养殖试验共进行8周。使用循环水养殖，水源为充分曝气的城市自来水，养殖期间不间断气泵充氧。饲养期间的水质条件为：水温28～31℃，溶解氧>4.0 mg/L，pH约7.0，氨氮<0.5 mg/L，亚硝酸盐<0.1 mg/L。

1.4 样品采集

养殖试验结束后，试验鱼饥饿24 h，每桶随机捞取3尾，麻醉(丁香酚，20 mg/L)后，测量体重和体长后，用1 mL注射器于尾部静脉取血，放于1.5 mL聚丙烯离心管中，存于4 ℃冰箱内静置2 h后以1 000g的转速离心10 min，提取上层血清并等量混合，保存于-80 ℃冰箱中；然后，取内脏、肝脏并称重；最后，取相同部位的肝脏和前肠，用生理盐水(0.9%氯化钠溶液)清洗后置于4%多聚甲醛溶液中，剩下的肝脏和肠道经生理盐水清洗，用液氮速冻后，放于-80℃冰箱中。待取样完毕后，称重和计数每桶剩下的鱼，另每桶再随机捞鱼3尾，放于密封袋中，于-20 ℃冰箱中保存。

1.5 样品检测和指标计算公式

采用105 ℃直接干燥法测定样品中的水分含量(GB/T 5009.3-2003)；凯氏定氮法测定样品中的粗蛋白含量(GB/T5009.5 -2003)；索氏抽提法测定样品中的粗脂肪含量( GB/T 5009.6- 2003)；550 ℃灼烧称重法测定样品中的灰分含量( GB/T 5009.4- 2003)。

血清生化指标使用全自动生化分析仪(迈瑞BS-460，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)检测，分析仪的试剂采购自深圳迈瑞生物医疗电子有限公司。共计检测10种指标，分别为血糖(GLU)、总蛋白(TP)、球蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)和总胆固醇(TC)的含量，以及谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的活性。

肝脏、幽门盲囊和肠道用4 ℃预冷的生理盐水(0.9%氯化钠溶液)清洗后，用滤纸吸干。称重后放入10 mL离心管中，按1∶9的比例加入预冷的生理盐水，经匀浆机匀浆并离心(1 500 g，10 min)取上清液后，待测。除称重外，所有操作均在冰上进行。蛋白酶的测定方法参考LIU等[20]。蛋白酶的活力单位定义为：1 mg组织蛋白在pH 7.2下水解酪蛋白，每分钟产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位(U/mg protein)。

肝和肠道组织标本固定24 h后，经过水洗、脱水、透明、石蜡包埋等步骤后，6 μm连续切片，HE染色。采用OLYMPUS CX41显微镜，OLYMPUS DP73数码相机进行图像采集。运用图像分析软件Image J 1.43 对HE染色结果进行分析、处理。每块组织随机选择4张照片，进行分析，测量方法参考LIU等[20]。

其余各指标参考刘伟等[21]，成活率(SR)、增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料效率(FE)、蛋白质效(PER)、蛋白质沉积率(PNR)、肥满度(CF)、肝体比(HSI)、脏体比(VSI)的计算公式如下：

SR=(Nf/Ni)×100%；

WGR=[(FW-IW)/IW]×100%；

SGR=[(lnFW-lnIW)/t]×100%；

FE=(Wf-Wi+Wd)/WA；

PER=[(Wf-Wi+Wd)/(WA×Wp)]×100%;

PNR={[WA×Wp-(Wf-Wi+Wd)×Fp]/(WA×Wp)]}×100%;

CF=(W/L3)×100;

HSI=(WH/W)×100%;

VSI=(WV/W)×100%。

其中，Ni和Nf分别为结束后和开始时鱼的尾数， FW和IW分别为试验鱼的初、末均体重(g)，t为试验天数(d)，Wi、Wf和Wd分别为试验鱼的初、末总体重和死亡鱼体重(g)，WA、Wp和Fp分别为投喂饲料总重(g)、饲料粗蛋白含量(%)和全鱼粗蛋白含量(%)，W为鱼体重(g)，L为鱼体长(cm)，WH和WV分别为肝脏重(g)、内脏团重(g)。

1.6 数据分析

所有数据采用平均值±标准差表示。采用SPSS 22.0 软件对试验数据进行统计分析。采用Tukey多重比较来检验试验处理均值间的差异显著性。取P<0.05 为差异显著。

2 结果

2.1 生长性能和饲料利用

养殖试验结束后，各组间成活率无显著差异，饲料蛋白酶水平对试验鱼的生长性能和饲料利用均有显著影响，而对肥满度、脏体比和肝体比无显著影响(表2)。各组间初均体重无显著差异，但随蛋白酶添加水平的增加，末均体重、增重率、特定生长率、饲料效率、蛋白质效率和蛋白质保留率均表现出先增加后降低的趋势，其中P20和P40组试验鱼的末体重、增重率和特定生长率显著高于P0组。在饲料利用指标方面，P20组的饲料效率、蛋白质效率和蛋白质保留率最高，显著高于P0组。以饲料蛋白酶添加水平和鱼体特定生长率做折线回归分析发现，饲料中蛋白酶水平为16 U/g时(图1)，试验鱼的生长速度达到最大。

图1 大口黑鲈饲料中蛋白酶水平和特定生长率的折线回归分析

表2 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈生长和饲料利用的影响

2.2 全鱼体成分

由表3可见，饲料中添加蛋白酶对试验鱼全鱼的水分、粗脂肪和灰分含量无显著影响，但对试验鱼全鱼粗蛋白质含量影响显著。随饲料中蛋白酶添加水平的增加，粗蛋白质含量有降低趋势， P0和P10组试验鱼的粗蛋白质含量显著高于P80组的，而与其它组差异不显著。

表3 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈全鱼体成分的影响

2.3 血清生化指标

由表4可见，饲料中蛋白酶水平对试验鱼的血糖(GLU)水平和碱性磷酸酶(ALP)活性有显著影响，而对其它指标无显著影响。其中，P20组试验鱼的GLU水平显著高于其它组；而饲料中添加蛋白酶后，试验鱼的血清ALP活性显著降低。

表4 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈血清生化指标的影响

2.4 蛋白酶活性

由表5可见，在肝脏和幽门盲囊中，随饲料中添加蛋白酶水平的增加，蛋白酶活性有降低的趋势。其中，P0组试验鱼的肝脏和幽门盲囊中蛋白酶活性最高，显著高于P20、P40和P80组的。在肠道中，P80组蛋白酶活性与P0组差异不显著，但显著高于其它组。

表5 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈肝脏、幽门盲囊和肠道的蛋白酶活性的影响

2.5 肠道组织结构

从图2可以看出，各组试验鱼的前肠褶皱整齐度较好，未发现损伤，各组间可见肠道上皮细胞、杯状细胞增生。从表6可以看出，饲料中添加蛋白酶增加了前肠的褶皱长度，尤其是P20和P40组，褶皱长度显著高于P0组。蛋白酶水平未影响肌肉层厚度和褶皱宽度。

图2 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈前肠组织结构的影响(40×)

表6 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈前肠形态结构的影响

2.7 肝脏组织结构

由图3可以看出，所有组的肝细胞结构较为完整，细胞膜、细胞核清晰可见，未见炎症细胞浸润，未见肝细胞损伤。但是，所有组的肝细胞均可见细胞膨大、核偏移的现象。

图3 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈肝脏组织结构的影响(400×)

3 讨论

3.1 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈生长性能和体成分的影响

饲料中添加适宜水平的外源蛋白酶可通过改善动物对饲料蛋白质利用率，促进动物生长[20,22]。

在本试验中，饲料中添加10、20、40 U/g蛋白酶可改善大口黑鲈的生长性能和饲料利效率，添加20 U/g组的作用最显著，但也发现80 U/g蛋白酶添加组，大口黑鲈的生长性能稍有下降，这在高水平蛋白酶添加对鲫[20]、鲤(Cyprinuscarpio)[23]，以及外源复合酶对欧洲鳇(Husohuso)[24]、莫桑比克罗非鱼(Oreochromismossambicus)[25]的研究中有类似的发现，造成鱼类生长下降的原因应该与过高的外源酶干扰了鱼体正常的生理代谢有关[26]，如过高的外源蛋白酶造成营养物质的分解、吸收产生变化[22]，导致试验鱼生长速度降低。

在本试验中发现，饲料中添加蛋白酶后有降低体粗蛋白含量的趋势，尤其是添加80 U/g蛋白酶组的鱼体粗蛋白含量显著降低，这与关莹等[17]研究利用棉籽替代鱼粉饲料后加入4.5～7.5 U/g中性蛋白酶，大口黑鲈体成分的变化结果一致，类似的研究结果在对欧洲鳇[24]、吉富罗非鱼(Oreochromisniloticus)[26]研究中也有所发现。在凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)[27]的研究中发现，在低鱼粉(10%)饲料中添加复合蛋白酶，随添加水平的增加，体粗蛋白含量增加；而在对中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)[22]、鲫[15,20]等的研究中，并未发现蛋白酶水平会影响鱼体粗蛋白含量。不同蛋白酶水平影响水产动物粗蛋白含量的原因，可能与试验对象、饲料配方、酶来源及添加水平有关，但仍需进一步研究。

3.2 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈血清生化指标的影响

血液学指标可反映出鱼类的健康状况[28]。在本试验中，仅发现摄食饲料中添加20 U/g蛋白酶的试验鱼血糖水平显著高于其它组。关莹等[17]也报道了投喂添加4.5 U/g中性蛋白酶的饲料后，大口黑鲈血糖显著升高，达到了约10 mmol/L，推测这可能与其糖异生作用增加有关，因为快速生长的鱼类生长激素水平升高，而生长激素有促进肝糖原分解，提高血糖的作用[29]。

AST存在于肝细胞线粒体中，ALT分布于肝细胞和胆管周围[30]，血清中AST和ALT活性的升高表示酶通过损伤的质膜泄漏或组织合成酶的增加[31]。而血清总蛋白、白蛋白、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的含量是监测机体营养状态和诊断疾病的指标。而在本试验中上述指标各组间均未表现出显著差异。碱性磷酸酶(ALP)是一组在碱性环境中能水解磷酸酯产生磷酸的酶。病理状态下，ALP主要用于肝病、骨病等的诊断和鉴别[32]。在本试验中，饲料中添加蛋白酶后ALP活性显著降低，结合肝脏的组织切片(图3)来看，表明饲料中添加蛋白酶后肝脏的功能应该有所改善。

3.3 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈体内蛋白酶活性的影响

在本试验中发现，除80 U/g蛋白酶组的试验鱼 肠道蛋白酶活性有所升高外，饲料中添加蛋白酶后试验鱼的肝脏、幽门盲囊蛋白酶活性有降低趋势，这表明添加外源酶可能引起了肝脏、幽门盲囊内源酶的“负反馈”反应。在青鱼(Mylopharyngodonpiceus)[33]、鲫[20]、吉富罗非鱼[26]中发现低鱼粉(<15%)饲料添加中性蛋白酶有提高肝脏或肠道蛋白酶活性的趋势，在对鲤的研究中也发现低鱼粉(6%)饲料中添加蛋白酶会增加肠道组织的蛋白酶活性[34,35]，而在高鱼粉(15%～20%)饲料中，添加蛋白酶却没有发现这种现象[35]，这表明鱼粉水平或是易消化蛋白原料的水平会影响肝脏或肠道蛋白酶活性，但是造成这种差异的具体原因需要进一步研究。

3.4 饲料蛋白酶水平对大口黑鲈肠道结构的影响

研究认为，饲料中补充蛋白酶可通过增加动物胃肠道氨基酸的代谢来减轻肠黏膜损伤，改善肠道完整性[36]。而在高剂量下，如果没有足够的底物或饲料蛋白质水解，过量的蛋白酶可能会诱导黏膜蛋白水解，导致试验动物肠道健康受损[27]。在本试验中发现肠道表观组织结构在各组间均比较完整，未发现有明显的变化，表明本试验添加的蛋白酶水平并未影响大口黑鲈肠道健康。在尼罗罗非鱼[28]、欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)[29]饲料中添加蛋白酶可以提高其前肠褶皱长度，这在本试验也有类似的发现，表明饲料中添加20～40 U/g蛋白酶改善了肠道结构，增加对营养物质的吸收[37]。

4 结论

在本试验条件下，以饲料蛋白酶添加水平和鱼体特定生长率做折线回归分析发现，饲料中添加16 U/g的蛋白酶即可使大口黑鲈的生长速度达到最大。饲料中添加适量蛋白酶可以改善大口黑鲈的生长性能和饲料利用，增加前肠褶皱长度，不会影响肝脏和肠道的表观健康状况。但添加80 U/g可导致体粗蛋白含量降低，不利于其营养价值。