补充β-胡萝卜素和虾青素对三角帆蚌内壳色、组织总类胡萝卜素含量及珍珠质量的影响

陆风辉，李金潞，白志毅，袁屹平，傅百成

(1.上海海洋大学，农业农村部淡水水产种质资源重点实验室/上海市水产养殖工程技术研究中心/上海市水产动物良种创新与绿色养殖协同中心，上海 201306；2.浙江佰瑞拉农业科技有限公司，浙江绍兴 311800)

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)为我国特有种，是我国最主要的淡水育珠蚌，具有重要的经济价值[1]。颜色是珍珠质量分级标准重要的评价指标之一[2]，为了丰富淡水珍珠产品颜色，提升珍珠品质，本实验室培育了三角帆蚌“申紫1号”新品种(GS-01-011-2017)，并实现紫色珍珠产业化养殖。但珍珠颜色不仅受到遗传调控的影响，也受到环境及其遗传互作效应的影响[3-5]，因此，良种需要配套良法，改进养殖方法也是提升珍珠色泽的重要途径之一。

类胡萝卜素(carotenoids)是一种利用率高、使用范围广的天然色素，水产动物通过从食物中摄取天然或合成形式的类胡萝卜素[6]，有利于其形成从深橙色到红色的不同程度的体色[7]。根据类胡萝卜素的化学构造差别可分为胡萝卜素和叶黄素两大类，β-胡萝卜素(β-carotene)是胡萝卜素中的代表；叶黄素是胡萝卜素的氧化衍生物，以角黄素和虾青素(astaxanthin)为代表[8-10]。三角帆蚌贝壳珍珠层及珍珠中含有的类胡萝卜素能够引起明显的拉曼峰，并且颜色越深的部位，类胡萝卜素相对浓度越高[11,12]。李西雷等[13]发现在三角帆蚌养殖水环境中添加β-胡萝卜素能够显著提高其体内总类胡萝卜素含量(total carotenoids content,TCC)并加深内壳颜色。孙明龙等[14]等通过对3个色系的三角帆蚌进行β-胡萝卜素补充投喂实验后也证实了其能够加深内壳颜色。上述研究都表明类胡萝卜素对三角帆蚌内壳色及组织内TCC积累起着重要促进作用，但仍缺乏投喂类胡萝卜素种类对贝壳颜色和珍珠性状的影响研究。

不同来源、不同种类的类胡萝卜素在水产动物体内的代谢途径不同[15-17]，并且不同类胡萝卜素源的价格差异也较大，因此有必要比较不同类胡萝卜素源对三角帆蚌贝壳颜色和珍珠颜色改善效果的差异。本研究选用紫色和白色2个色系三龄插核三角帆蚌，通过添加β-胡萝卜素和虾青素，进行了为期120 d的补充投喂养殖实验，测定三角帆蚌体内TCC的富集及其内壳色差异，并重点比较分析添加β-胡萝卜素和虾青素对三角帆蚌培育珍珠质量的影响，以期为改善养殖珍珠颜色筛选出合适的类胡萝卜素，也为滤食性贝类补充功能性营养添加剂研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及实验试剂

实验用紫色系和白色系三角帆蚌均为同期自插三龄育珠蚌，取自上海海洋大学安徽宣城基地，随机挑选两种色系三角帆蚌各100只，规格统一，壳长(150.74±23.18) mm。淡水小球藻藻种(纯度≥95%)购自南京海洱斯生物科技有限公司，β-胡萝卜素(含量规格1%)购自西安维特生物科技有限责任公司，可溶于水的微囊包埋虾青素(含量规格1%)购自西安明朗生物科技有限公司，次氯酸钠(CP，活性氯≥5.2%)、丙酮(AR)和无水硫酸钠(AR)试剂均购自上海沪试实验室器材股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 饲养管理

实验养殖系统为三层两列“V”字形养殖水槽架(1.20 m×0.35 m×0.40 m)(图1)，每个水槽底部均设有增氧管道，中层为“V”字形可拆卸网状透气养殖不锈钢架，养殖水体体积为80 L，以曝气24 h以上的自来水作为养殖用水。使用室外6管(容积共1 480 L)智能透明光生物反器扩培淡水小球藻(Chlorellavulgaris)，每管培养密度高于1.2×107cell/mL即可作为基础饵料进行投喂。实验开始前，将实验用蚌放置于养殖系统中暂养一周，期间保持稳定充气增氧，使其逐渐适应新的实验养殖环境。按照三角帆蚌的常规养殖要求进行日常管理，使用AZ-86031便携式高精度溶氧仪(衡欣，台湾省)测量水体环境变量，保持水温在25～27 ℃内，pH在6～8、溶氧量大于>5.0 mg/L。每日9:00和17:00使用扩培后的小球藻进行投喂，投喂密度为养殖水体中小球藻浓度达1.0×106cell/mL，次日起仅第一次投喂前换水，换水量为1/3，每隔7 d使用高压水枪冲洗不锈钢架和水槽壁上黏附的污物。

图1 单个三角帆蚌养殖水槽装置

1.2.2 实验设计

紫色和白色2种色系的三角帆蚌分别设置β-胡萝卜素补充实验组、虾青素补充实验组和对照组，每组下设3个平行组，每个平行组饲喂紫色系和白色系三角帆蚌各10只。除投喂基础小球藻饵料外，实验组分别添加β-胡萝卜素粉和虾青素微囊粉，添加量均为水体中粉剂质量浓度达40 mg/L，实验周期为120 d。实验结束后从每组中随机取出3个三角帆蚌，解剖后分别取肝胰腺、外套膜(边缘膜)、中央膜和斧足组织，置于-80 ℃保存，取出插核珍珠后清洗干净，拭干水分放入棕色试管中密封避光保存待用。取样后的三角帆蚌贝壳清洗干净，自然风干后避光保存，以备进行内壳色测量。

1.2.3 总类胡萝卜素的提取及含量测定

将组织样品放入真空冷冻干燥机中处理48 h后，取出样品置于高速粉碎机中少时多次进行粉碎，并过300目筛筛选得到各组织样品粉末，每次粉碎作业后使用毛刷清理干净粉碎机内壁及顶盖。称取上述过筛后的组织粉末0.2 g，放入10 mL棕色试管中，加入等量无水硫酸钠和4 mL丙酮充分混匀，37 ℃条件下避光250 r/min震荡提取120 min，然后置于离心机中离心5 min取上清，管内沉淀重复上述步骤浸提3～4次直至无色，合并上清液后定容。使用SpectraMax 190型分光光度计(Molecular Devices，USA)在避光条件下测定丙酮提取液的吸光值。总类胡萝卜素含量的测定参照文献[18]，计算公式如下:

1.2.4 内壳色参数测定

使用Lovibond RT200表面色度计(Tintometer,UK)对保存的贝壳内壳色进行颜色参数测定，通过Lovibond RT Colour V3.0软件中的CIE L*a*b*图像处理方式输出测量数据。颜色测量参数包括明度(L*)、色度值(a*)、色度值(b*)和色差(dE)，参数意义见文献[14]。测量位置依次为前闭壳肌、右壳边缘部位的外套痕与纵肋的交叉处和后闭壳肌，取每个蚌3个点的颜色参数平均值作为该个体的内壳色数据。

1.2.5 珍珠圆度、颜色及光泽度测定

使用数显千分尺(0.001 mm)测量珍珠的最大直径和最小直径，珍珠圆度用直径差百分比X表示，值越小表明珍珠越圆，计算方法参照文献[19]等，计算公式为：

珍珠洗净后置于1%次氯酸钠溶液中浸泡5 min除去微隙间杂质，再次洗净风干备用。珍珠颜色参数测定方法同1.2.4，将珍珠置于凹面槽中固定，分别选取表面3处光滑洁净的点位进行测量，取每颗珍珠3个点的颜色参数平均值作为该颗珍珠的颜色数据。使用Digital Lux Meter检测环境光强，并对小孔曲面光泽仪NOVO-CURVE(Rhopoint,UK)进行校准，校准完毕后将取样保存的珍珠依次放在小孔曲面光泽仪的检测孔处，每颗珍珠检测同一位点3次，以3次检测结果平均值作为该珍珠的光泽度数据。

1.2.7 数据统计与分析

2 结果

2.1 补充β-胡萝卜素和虾青素对三角帆蚌内壳色的影响

投喂120 d后测得实验组三角帆蚌内壳色参数结果见表1。结果显示，紫色系三角帆蚌实验组内壳颜色参数b*和dE表现出显著性差异，其中补充β-胡萝卜素组中b*从-1.09±1.51降至-4.61±1.54，dE从13.06±4.27升至18.25±2.84，提高了39.74%；补充虾青素组中b*从-1.09±1.51降至-4.54±2.47，dE从13.06±4.27升至19.04±2.62，提高了45.79%，而L*和a*较对照组均差异不显著。白色系三角帆蚌实验组中，补充β-胡萝卜素组内壳颜色参数(L*、a*、b*和dE)均与对照组差异不显著；补充虾青素组内壳颜色参数仅a*从-0.23±1.32升至3.41±1.55，其余参数(L*、b*和dE)也均不显著。

表1 补充β-胡萝卜素和虾青素对2种色系三角帆蚌内壳色的影响

2.2 补充β-胡萝卜素和虾青素对三角帆蚌组织内TCC的影响

各实验组三角帆蚌组织内TCC见表2。从表中可以看出，补充类胡萝卜素120 d后，三角帆蚌肝胰腺和外套膜边缘膜组织中TCC均显著提高，但不同色系三角帆蚌肝胰腺和外套膜边缘膜组织对β-胡萝卜素和虾青素的富集能力差异显著，其对虾青素的吸收效果优于β-胡萝卜素。紫色系三角帆蚌实验组肝胰腺、外套膜边缘膜和中央膜的TCC较对照组均有显著提高，其中补充β-胡萝卜素组分别提高了128.19%、24.12%和41.24%，而补充虾青素组分别提高了502.82%、52.64%和68.12%。白色系三角帆蚌实验组肝胰腺和外套膜边缘膜的TCC显著高于对照组，其中补充β-胡萝卜素组分别提高了43.90%和36.34%，而补充虾青素组分别提高了327.74%和90.21%，中央膜TCC较对照组未见显著变化。不同色系三角帆蚌斧足TCC均无明显变化。

表2 补充β-胡萝卜素和虾青素对2种色系三角帆蚌组织TCC的影响

2.3 补充β-胡萝卜素和虾青素对三角帆蚌所育珍珠质量的影响

各实验组三角帆蚌所育珍珠质量差异见表3。结果显示，补充不同类胡萝卜素后，同色系三角帆蚌所育珍珠的颜色存在差异。在紫色系三角帆蚌实验组中，仅补充虾青素组的珍珠颜色参数L*、b*和dE较对照组则有显著变化，a*无明显变化，L*从88.73±1.33降至85.09±1.27，b*从-3.87±1.30降至-5.74±1.29，dE从12.64±1.43升至16.75±1.68。在白色三角帆蚌实验组中，珍珠颜色参数b*和dE较对照组差异显著，其中补充β-胡萝卜素组的珍珠颜色参数b*从-4.63±0.98降至-5.57±1.55，dE从14.88±0.93升至16.00±1.13；补充虾青素组的珍珠颜色参数b*从-4.63±0.98降至-5.06±1.82，dE从14.88±0.93升至16.12±2.69，而L*和a*均未见显著变化。实验结束时，不同色系三角帆蚌所育珍珠的圆度与对照组无明显差异。通过补充类胡萝卜素，紫色系三角帆蚌的珍珠光泽度未呈现显著差异；白色系三角帆蚌的珍珠光泽度较对照组则有显著变化，β-胡萝卜素组和补充虾青素组分别从33.58±2.87升至40.26±2.86和42.72±3.91，提高了19.89%和25.67%。

表3 补充β-胡萝卜素和虾青素对2种色系三角帆蚌所育珍珠颜色、圆度和光泽度的影响

3 讨论

3.1 类胡萝卜素的种类在贝类组织中积累差异

水产品中肉质粉红的鱼类、鱼卵以及虾、软体动物壳等含有大量类胡萝卜素[20]。由于动物本身及其各种组织对类胡萝卜素的需求具有特殊性，因此不同水产动物各组织累积的类胡萝卜素种类和含量各不相同[21]。全成等[22]在饵料中添加叶黄素后单独和混合投喂黄颡鱼，研究其组织中叶黄素的沉积水平，结果发现投喂叶黄素42 d后肝脏和肌肉中的叶黄素水平显著增加。Li等[23]研究发现海大金贝外套膜和肾脏等组织中果胶黄质含量显著高于正常扇贝。本实验中选用的紫色系和白色系三角帆蚌在同一环境养殖，结果显示，在紫色系三角帆蚌实验组中肝胰腺、外套膜边缘膜和中央膜的TCC均显著高于对照组，且除斧足外添加不同类胡萝卜素的实验组之间也存在显著差异。在白色系三角帆蚌中，各实验组肝胰腺和外套膜边缘膜的TCC均显著高于对照组，中央膜和斧足差异不显著。李庆昌等[24]通过研究波纹巴非蛤各组织总类胡萝卜素含量发现其斧足中TCC最高。而本研究中不同色系三角帆蚌的斧足TCC含量均为最低，推测其原因可能是不同贝类之间相同组织对TCC的吸收能力是不同的。前人研究表明，肝胰腺是转化沉积类胡萝卜素的主要场所[25,26]，可将机体需要的类胡萝卜素转运至其他组织器官中，本实验不同色系三角帆蚌的肝胰腺TCC均最高也表明了肝胰腺组织在类胡萝卜素代谢过程中发挥重要作用。紫色系三角帆蚌肝胰腺TCC显著高于白色系个体，表明不同色系的三角帆蚌吸收转运类胡萝卜素能力不同。此外，2种色系三角帆蚌实验组中，补充虾青素组的三角帆蚌TCC提升程度远高于补充β-胡萝卜素组个体，表明三角帆蚌更易吸收累积虾青素形式的类胡萝卜素。综上，表明不同种质三角帆蚌的各组织对β-胡萝卜素和虾青素的富集能力存在差异。

3.2 添加类胡萝卜素对贝类壳色和珍珠颜色的影响

类胡萝卜素是影响贝类壳色的重要因素之一[27]。本实验通过补充β-胡萝卜素和虾青素，紫色系三角帆蚌内壳色参数b*和dE均显著增加，即更加趋向蓝色度且颜色加深；白色系三角帆蚌仅补充虾青素组的内壳色参数a*显著增加，即更加趋向红色度，这与孙明龙[14]等补充β-胡萝卜素实验中白色系三角帆蚌壳色均未见明显变化的结果不同，推测延长添加类胡萝卜素投喂周期可以提升三角帆蚌内壳红度、蓝度和颜色深度，同时其种类对壳色提升效果有影响，后续可通过时间梯度实验进一步验证。华贵栉孔扇贝(Chlamysnobilis)橘黄色壳色个体TCC显著高于棕色壳色个体[28]，进一步证明了贝类壳色受种质转化类胡萝卜素能力的影响。马孝甜[29]研究发现马氏珠母贝摄食转化虾青素后能显著改变其肉色和壳色。YAN等[30]利用UV-Vis反射光谱结合场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)对同一三角帆蚌贝壳中乳白色和粉紫色的珍珠层进行了对比分析，发现其吸收峰强度随类胡萝卜素浓度的增加而增大，也验证了类胡萝卜素与三角帆蚌内壳色有着密切的联系。

外套膜TCC与珍珠层颜色存在明显的相关性，珍珠颜色的形成机理与贝壳珍珠层一致[31,32]。韩继卫等[33]以低浓度的β-胡萝卜素饲喂三角帆蚌后发现其能够有效提高三角帆蚌早期珍珠的色泽度。本实验中紫色系三角帆蚌中补充虾青素组的珍珠颜色参数显著变化，补充β-胡萝卜素组珍珠颜色未见显著性差异，而补充这2种类胡萝卜素对白色系三角帆蚌的珍珠颜色均有显著提升，但珍珠颜色是否能保持稳定仍需进一步的研究。虾青素是类胡萝卜素合成的终点，可以不通过修饰转化而直接被贮存在动物组织中[34]，而β-胡萝卜素被三角帆蚌摄取后需要转化利用，通过较长时间的生理过程才能对珍珠颜色产生影响，这可能是导致本实验中紫色系三角帆蚌珍珠颜色参数变化规律不一致的原因。白色系三角帆蚌所育珍珠光泽度显著提升，紫色系个体则未见显著性差异，表明三角帆蚌累积类胡萝卜素后可以改善珍珠的光泽度。综上，在三角帆蚌的养殖水体中添加类胡萝卜素，能够提升其壳色参数进而影响育珠质量，改善珍珠的颜色和光泽度，具有一定的生产应用前景。

致谢：感谢宁波大学海洋学院水产养殖系提供培养小球藻的3#培养基配方。