pro-GRP和Napsin A在肺癌组织中的表达水平及与临床预后的关系

张文静 张光亮 苏亚丽 齐 林

肺癌是世界上诊断率最高的癌症，也是最常见的癌症死亡原因[1]。根据GLOBOCAN 2020全球癌症统计数据显示，肺癌占全世界所有新增癌症病例的11.4%，仅次于乳腺癌，18%(180/1000万例)的全球癌症相关死亡是由肺癌引起的[2]。据估计，2035年肺癌死亡病例将增加至300万[3]。尽管非侵入性诊断技术的进步提高了发现肺癌的可能性，但仍然只有10%～15%的病例是在临床早期诊断，75%的患者确诊时已处于肺癌晚期，患者预后较差[4]。因此，肺癌的早发现和早诊断对于改善患者临床预后至关重要。胃泌素释放肽前体(progastrin-releasingpeptide，pro-GRP)是胃泌素释放肽(GRP)的前体，GRP是一种参与生理消化过程的胃肠激素，GRP、pro-GRP二者均与肺癌在内的肿瘤发生发展密切相关[5]。天冬氨酸肽酶A(Napsin A)在肺腺癌的诊断中有着广泛的应用，是原发性肺腺癌的一种特异标志物[6]。本研究通过检测pro-GRP和Napsin A在肺癌组织及其癌旁组织中的表达水平，分析二者阳性表达率与肺癌临床预后的关系，旨在为更加深入阐明pro-GRP和Napsin A在肺癌发生发展中的作用奠定理论基础及为肺癌的治疗及临床预后评估提供参考根据，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2017年2月至2018年2月医院收治的93例肺癌患者，并收集手术切除的癌组织标本及其相应的癌旁组织(距离肿瘤边缘5 cm以上的正常组织)标本。纳入标准：①经术后病理明确诊断为肺癌；②术前未接受任何抗癌治疗，包括放疗、化疗以及靶向药物治疗等；③临床及随访资料齐全。排除标准：①合并其他部位恶性肿瘤者；②排除远处转移者；③严重功能器官障碍者。93例肺癌患者中，包括男性患者57例，女性患者36例，年龄50～83(66.09±7.48)岁；54例腺癌，24例鳞癌，15例小细胞肺癌；临床分期：Ⅰ、Ⅱ期40例，Ⅲ期53例；分化程度：低中分化52例，高分化41例；有淋巴结转移45例，无淋巴结转移48例。患者均对本研究知情，且本研究获得了医院医学伦理委员会的批准及通过。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集全部肺癌患者临床资料，统计患者性别、年龄、肿瘤大小、病理类型、临床分期、分化程度、淋巴结转移以及随访3年的生存情况，末次随访时间为2021年2月。

1.2.2 免疫组织化学染色 收集全部患者癌组织标本(肺癌组)及距离肿瘤边缘5 cm以上的正常肺组织标本(对照组)，癌组织经术后病理明确诊断为肺癌。癌组织标本与癌旁组织标本经10%甲醛溶液固定，常规酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，并制成4 μm层厚的切片。采用免疫组织化学染色法检测标本中pro-GRP和Napsin A表达水平，具体操作步骤如下，将切片置于PH6.0的柠檬酸盐缓冲液(0.01 mmol/L)中进行高温高压抗原修复，时间2 min，待切片冷却后使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，加入一抗[pro-GRP(1∶100)、Napsin A(1∶50)]，4 ℃条件下中孵育过夜；使用磷酸盐缓冲液冲洗3次，加入二抗溶液，37 ℃条件下孵育30 min，使用磷酸盐缓冲液冲洗3次；DAB显色、苏木精复染、中性树胶封片，于光学显微镜下观察pro-GRP和Napsin A表达情况。

1.2.3 免疫组织化学染色结果判定 由两位高年资病理科医生独立观察免疫组织化学染色后的切片，若存在不同意见则由两位共同商议并最终确定。每张切片随机选取5个高倍镜视野进行观察(400×)，染色强度评分：无染色记作0分，浅黄色记作1分，棕黄色记作2分，棕褐色记作3分。阳性细胞占百分比评分：无阳性细胞记作0分，阳性细胞<10%记作1分，阳性细胞10%～50%记作2分，阳性细胞>50%记作3分。以染色强度评分与阳性细胞占百分比评分相加作为最终染色评分，0～2分表示阴性表达，3～6分表示阳性表达。

1.3 观察指标

比较癌组织及癌旁组织中pro-GRP和Napsin A表达阳性率；比较pro-GRP、Napsin A阳性表达和阴性表达肺癌患者临床病理特征；分析pro-GRP和Napsin A表达水平与肺癌患者临床预后的关系。

1.4 统计学方法

应用SPSS 23.0软件对数据进行分析，计数资料以例数(n)或百分比(%)表示，比较进行χ2检验；采用单因素和多因素Cox回归模型分析影响肺癌患者临床预后的独立危险因素，以P<0.05表示数据之间的比较具有统计学意义。

2 结果

2.1 pro-GRP、Napsin A在癌组织及癌旁组织中的表达水平

肺癌组pro-GRP阳性表达率显著高于对照组(P<0.05)，Napsin A阳性表达率显著低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 pro-GRP、Napsin A在癌组织及癌旁组织中的表达水平(例，%)

2.2 pro-GRP、Napsin A在肺癌中的表达水平与临床病理特征的关系

pro-GRP阳性表达与肺癌患者肿瘤大小、临床分期、分化程度以及淋巴结转移有关(P<0.05)，Napsin A阳性表达与肺癌病理类型、临床分期、分化程度以及淋巴结转移有关(P<0.05)。见表2。

表2 pro-GRP、Napsin A在肺癌中的表达水平与临床病理特征的关系(例，%)

2.3 pro-GRP、Napsin A表达水平与肺癌患者临床预后的关系

随访3年，全部患者均获得随访，其中死亡62例，生存31例。死亡组pro-GRP阳性表达率显著高于生存组(P<0.05)，Napsin A阳性表达率显著低于生存组(P<0.05)。见表3。

表3 pro-GRP、Napsin A表达水平与肺癌患者临床预后的关系(例，%)

2.4 pro-GRP、Napsin A表达水平与肺癌患者临床预后的多因素Cox分析

单因素分析结果显示，临床分期、分化程度、淋巴结转移以及pro-GRP、Napsin A表达水平与肺癌患者临床预后有关；多因素Cox风险回归分析显示，分化程度(γ=1.955，95%CI：1.313～2.916，P=0.002)、淋巴结转移(γ=2.584，95%CI：1.509～4.407，P=0.001)、pro-GRP表达水平(γ=1.581，95%CI：0.872～2.653，P<0.001)、Napsin A表达水平(γ=2.063，95%CI：1.429～2.989，P<0.001)是影响肺癌患者临床预后的独立因素。见表4。

表4 影响肺癌患者生存预后的单因素和多因素Cox分析

3 讨论

目前，肺癌仍然是癌症死亡的主要原因，我国肺癌发病率及死亡率依旧遥居所有恶性肿瘤首位，且在年轻人中的发病率呈上升趋势[7-8]。肺癌的临床治愈率较低，大部分患者在进行手术治疗后仍存在疾病复发的可能性，患者临床预后不甚理想[9]。因此，深入了解肺癌的致病机制，并探索肺癌潜在的治疗靶点以及临床预后预测因子具有重要的意义。

GRP是一种蛙皮素类似物，有报道指出，小细胞肺癌肿瘤细胞能够合成和释放GRP，并与肿瘤发生发展有关[10]。GRP不稳定，半衰期短(2 min)，而pro-GRP是一种稳定的蛋白质，半衰期较长(19～28天)，pro-GRP与GRP具有共同的C端序列，可以代表GRP的水平以及基因表达情况[11]。除胎盘和胚胎组织外，pro-GRP在正常成人组织中很少表达，在外周血中表达较稳定。多项研究[12-13]证实，pro-GRP诊断小细胞肺癌具有较高的敏感性和特异性，在肺癌肿瘤筛查中具有良好的应用价值。Napsin A是一种功能性的天冬氨酸蛋白酶，能够参与疏水性肺表面活性蛋白的水解，从而维持肺正常形态和功能[14]。在正常生理情况下，Napsin A于Ⅱ型肺泡上皮细胞以及肺泡巨噬细胞中表达，在肺腺癌组织中多呈阳性表达，但在鳞癌、小细胞癌中几乎不表达[15]。本研究结果显示，肺癌组pro-GRP阳性表达率显著高于对照组，Napsin A阳性表达率显著低于对照组，且肺癌患者中pro-GRP表达水平存在差异的患者其肿瘤大小、临床分期、分化程度以及淋巴结转移存在显著差异，而Napsin A表达水平存在差异的患者其病理类型、临床分期、分化程度以及淋巴结转移亦存在显著差异，表明pro-GRP和Napsin A表达水平可能与肺癌发生发展存在关联。肺癌细胞可合成并释放pro-GRP，且pro-GRP能够经过旁分泌作用促进肿瘤生长，从而在肿瘤侵袭、转移中发挥重要作用。Napsin A的减少、缺失能够促进肺癌进展，该基因缺失表达可能使得细胞更加具有侵袭性。杨金华等[16]报道也表明，非小细胞肺癌组织中pro-GRP表达明显升高，并可能参与非小细胞肺癌的发生发展。杜旭升等[17]研究同样认为，检测Napsin A表达有助于判断肺癌患者病情。本研究中，随访3年发现，死亡组pro-GRP阳性表达率显著高于生存组，Napsin A阳性表达率显著低于生存组，表明pro-GRP上调表达以及Napsin A下调表达能够提示肺癌患者不良预后。马永峰等[18]报道也发现，pro-GRP阳性表达与非小细胞肺癌患者不良预后有关，死亡患者pro-GRP阳性表达率显著高于生存患者，通过检测pro-GRP表达水平并对患者及时给予干预，有可能减少患者术后复发、转移的风险。李燕舞等[19]研究显示，血清pro-GRP高水平肺鳞癌患者总体生存率明显低于低水平患者，分析pro-GRP表达水平能够为患者预后评估提供重要指导。文献报道[20]则指出，Napsin A在高分化肿瘤中过表达，且Napsin A表达缺失是肺癌患者生存期缩短的独立因素。本研究多因素Cox风险回归分析显示，分化程度、淋巴结转移、pro-GRP和Napsin A表达水平是影响肺癌患者临床预后的独立因素。临床上通过对低中分化、有淋巴结转移、pro-GRP阳性以及Napsin A阴性患者尽早进行干预，有助于改善肺癌患者预后。此外，通过对肺癌组织中pro-GRP和Napsin A表达水平进行分析研究，有助于深入阐明肺癌发生发展的机制，同时pro-GRP和Napsin A也有可能成为预测肺癌临床预后的重要生物标志物。但本研究仅分析了pro-GRP和Napsin A的免疫组织化学染色结果，二者在肺癌中上调表达和下调表达的具体机制有待明确，后续还需要开展更加深入的研究。

综上所述，肺癌组织中pro-GRP表达水平上调，Napsin A表达水平下调，且二者表达水平与患者临床预后存在密切关联，有可能作为肺癌潜在的治疗靶点以及临床预后预测因子。