槲皮素金属配合物抑制胆囊癌细胞增殖、侵袭及增强化疗敏感性的机制分析

刘 涛 白 浪 高永涛

胆囊癌是胆道系统常见的恶性肿瘤[1]，流行病学研究发现我国胆囊癌发病率占同期胆道疾病0.4%～3.8%，位列消化道肿瘤发病率第6位[2-3]。由于胆囊癌具有恶性程度高、易发生区域淋巴结转移及远处转移、放化疗敏感性差等临床生物学特性，胆囊癌患者总体预后较差，5年生存率不足5%[4-5]。对于晚期胆囊癌患者，姑息性放化疗能减缓肿瘤进展、缓解疼痛、改善总体生存率，有结果显示联合放化疗是能延长病人总体生存时间，然而目前对胆囊癌化疗方案存在争议[6]。吉西他滨(gemcitabine，GEM)联合顺铂(cisplatinum，DDP)是进展期胆道肿瘤治疗的首选化疗方案[7]，然而大多数胆囊癌患者的癌细胞对GEM是耐药的，因此对GEM耐药机制探讨成为近年来胆囊癌化疗研究的热点。槲皮素(quercetin)是从以槲皮类植物中提取出来的一种黄酮类化合物，化学名为3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮，近几年来，已有研究证实槲皮素对多种实体肿瘤具有抑制作用[8-9]，但对胆囊癌细胞的作用研究较少，本研究通过将槲皮素金属配合物与胆囊癌GBC-SD细胞共培养，检测细胞的增殖及侵袭能力的变化以及细胞内hENT-1表达变化，以期为胆囊癌GEM耐药机制提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

胆囊癌细胞株GBC-SD购自中国科学院上海细胞所细胞库；胎牛血清、DMEM培养液( Gibco 公司);0.25% 胰酶( Hyclone公司);侵袭小室( Sigma公司)、CCK-8 试剂盒(北京博奥森公司)、PCR引物序列由北京生物工程有限公司设计合成。

1.2 细胞培养

用含10% FBS的DMEM完全培养基，在37 ℃，5% CO2，相对湿度95%的恒温孵育箱中培养人胆囊癌GBC-SD细胞；将GBC-SD细胞按接种于96孔板中，按0、10、20、40、80、160 μmol/L的 Co(Que)2药物浓度将细胞分为6组，CCK8法测定GBC-SD细胞的生长曲线，确定Co(Que)2的最佳实验浓度，每组实验重复3次。

将最佳试验浓度Co(Que)2、GEM等不同组合与人胆囊癌GBC-SD细胞培养，细胞克隆形成实验检测对GBC-SD细胞增殖的影响；划痕实验和 Transwell体外侵袭实验检测细胞侵袭迁移能力的影响。

将最佳试验浓度Co(Que)2、GEM等不同组合与人胆囊癌GBC-SD细胞培养，Trizol法提取各组细胞总RNA，RT-PCR法测量细胞内hENT-1 mRNA的相对表达，反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环，用 hENT-1/β-actin 的比值表示hENT-1 mRNA的相对表达量。

1.3 统计方法

2 结果

2.1 槲皮素金属配合物与胆囊癌GBC-SD细胞系共培养

将不同浓度Co(Que)2与胆囊癌GBC-SD细胞共培养24 h后，随着浓度的增加，Co(Que)2对胆囊癌GBC-SD细胞抑制率亦增高，160 μmol/L的 Co(Que)2对GBC-SD细胞的抑制率达(83.5±15.8)%，与其他不同浓度抑制率有统计学差异(F=35.12，P<0.0001)(图1A)。将50 μmol/L的Co(Que)2与GBC-SD细胞培养不同时间后，培养120 h后Co(Que)2对GBC-SD细胞的抑制率达(87.7±12.6)%，与其他组有统计学差异(F=25.44，P<0.0001)(图1B)，表明Co(Que)2对GBC-SD细胞增殖抑制作用呈时间及浓度依赖性。

注：A为不同浓度Co(Que)2培养24 h；B为50 μmol/L培养不同时间。

2.2 Co(Que)2抑制GBC-SD细胞增殖、侵袭

将浓度为50 μmol/L的Co(Que)2与胆囊癌GBC-SD细胞共培养24 h后，细胞克隆形成实验检测对GBC-SD细胞增殖的影响，结果显示Co(Que)2+GEM联合培养后细胞克隆数目形成最少(114±16)，与其他组有统计学差异(F=20.06，P<0.0001)，Co(Que)2组细胞克隆数目(195±20)，高于正常对照组(t=32.18，P<0.0001)(图2)。采用划痕实验、Transwell小室检测共培养后胆囊癌GBC-SD细胞转移和侵袭能力的变化，Co(Que)2+GEM组细胞迁移数目(95±16.7)低于NC组(158±31.7)和GEM组(128±27.4)，差异有统计学意义(F=15.34，P=0.0015)(图3)。

图2 细胞克隆形成实验检测Co(Que)2对GBC-SD细胞增殖的抑制作用

图3 划痕实验和 Transwell体外侵袭实验检测Co(Que)2对GBC-SD细胞迁移、侵袭能力的抑制作用

2.3 Co(Que)2上调GBC-SD内hENT-1 mRNA的表达

将浓度为50 μmol/L的Co(Que)2与胆囊癌GBC-SD细胞共培养24 h后，RT-PCR检测GBC-SD内hENT-1 mRNA的表达，Co(Que)2+GEM组 hENT-1 mRNA 的表达为(0.61±0.15)，明显高于空白对照组(0.42±0.07)和GEM组(0.48±0.09)，差异有统计学意义(F=3.986，P=0.0471)。

3 讨论

目前对胆囊癌化疗方案存在争议[10]。2010年，ValleJ等在新英格兰杂发表文章，发现GEM联合DDP组中位生存期(11.7个月)明显高于GEM单药组(8.1个月)[11]，从而确立GEM联合DDP方案为进展期胆道肿瘤治疗的首选化疗方案。但多项Ⅱ期临床试验报道以GEM为主的化疗方案对胆囊癌的客观缓解率仅在20%～36%之间[12-13]，提示大多数胆囊癌患者的癌细胞对GEM是耐药的，因此对GEM耐药机制探讨成为近年来胆囊癌化疗研究的热点。GEM是一种胞嘧啶核苷衍生物，在肿瘤细胞DNA合成期通过半胱氨酸天冬氨酸酶级联放大系统诱导细胞凋亡[14-16]，然而亲水性的GEM通过细胞膜的脂性结构极为困难，其主要通过hENT-1进入细胞内[17]，因此，hENT-1蛋白和mRNA表达水平被认为是预测 GEM临床疗效最具潜力的生物标志物[18]。

槲皮最早记载于唐朝苏敬等奉敕于显庆四年(公元659年)编撰的《唐本草》，槲皮素(Quercetin)是从以槲皮类植物中提取出来的一种黄酮类化合物，化学名为3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮，近几年来，已有研究证实槲皮素对多种实体肿瘤具有抑制作用，但对胆囊癌细胞的作用研究较少。

目前研究显示槲皮素及其金属配合物的抗肿瘤机制主要集中在以下几个方面。①抑制端粒酶的活性：槲皮素能够抑制端粒酶的活性，破坏其稳定性，诱导细胞凋亡；②调控肿瘤的癌基因与抑癌基因：槲皮素在翻译水平抑制突变型P53蛋白的表达，抑制c-myc、ras等癌基因及上调P21等抑癌基因的表达；③阻滞细胞周期：槲皮素能减少癌细胞DNA的复制,使细胞周期阻滞于G1期、G2/M期；④阻遏热休克蛋白(Heat Shock Protein，HSP)：槲皮素可以在基因转录水平抑制HSP的表达，增加肿瘤细胞对放、化疗的敏感性，诱导细胞凋亡；⑤抑制肿瘤新生血管的形成：槲皮素可能通过抑制基质MMP-2和MMP-9的活性来抑制肿瘤新生血管的生成，从而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制转移；⑥逆转肿瘤多药耐药：槲皮素可以通过下调热休克蛋白HSP70的表达和抑制P糖蛋白的功能，发挥逆转多药耐药功能[19-22]。本研究通过将Co(Que)2与GBC-SD细胞共培养发现，Co(Que)2对GBC-SD细胞增殖抑制作用呈时间及浓度依赖性，而且能抑制GBC-SD细胞的侵袭与转移，通过RT-PCR检查细胞内hENT-1 mRNA表达，结果显示Co(Que)2使GBC-SD细胞内hENT-1 mRNA表达上调，因此我们推测，Co(Que)2通过上调GBC-SD细胞内hENT-1 mRNA的表达，进而增强GEM对GBC-SD细胞的化疗敏感性，进而抑制细胞增殖、转移侵袭能力。

本研究结果表明，槲皮素金属配合物能够有效地抑制胆囊癌细胞的增殖、侵袭迁移，其机制主要通过上调hENT-1增强吉西他滨对胆囊癌细胞化疗敏感性，为胆囊癌吉西他滨耐药机制探讨提供实验基础。