橙皮苷通过MeCP2/Wnt轴对口腔鳞状细胞癌恶性生物学行为的作用机制

李国芳 韩永付 郑 雷 李晓琰 高振杰

口腔鳞状细胞癌(oral squamous-cell carcinoma，OSCC)是头颈部常见的恶性肿瘤，其发病率居口腔癌首位，且逐年攀升并趋于年轻化[1]。目前临床治疗OSCC通常采用化疗联合手术切除，但由于肿瘤生长位置特殊，可能会损坏患者面部形象或造成面部器官功能障碍，治疗效果并不理想[2]。此外，OSCC隐蔽性强，部分患者确诊时已处于晚期，出现组织浸润及淋巴结转移，以致患者病死率居高不下[3]。橙皮苷是柑橘类成熟果皮和组织中的类黄酮物质，有研究证明，其可通过抑制人肝癌和神经母细胞瘤细胞增殖并诱导其凋亡来发挥抗癌功效[4]。然而，目前关于其对于OSCC细胞的作用及相关机制鲜有报道。本研究采用橙皮苷干预OSCC细胞，观察其对该细胞克隆、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响，并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人OSCC CAL27细胞系、人口腔黏膜角质形成细胞(Human Oral Keratinocytes，HOK)系，购自中国科学院上海细胞库。

1.1.2 药物、主要试剂、仪器 橙皮苷(纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)全蛋白提取试剂盒、pcDNA 3.1-甲基化CpG结合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)质粒(上海联硕生物科技有限公司)，LipofectamineTM3000试剂盒(上海臻诺生物科技有限公司)，兔抗人MeCP2、Wnt-1、β-连环蛋白(β-catenin)、腺瘤样结肠息肉病(adenomatous polyposis coli，APC)蛋白一抗(美国Santa公司)。

倒置荧光显微镜(德国Leica公司)，DYCZ-24电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，Gel Doc XR+一体式凝胶成像分析仪(美国伯乐公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人OSCC CAL27细胞、HOK细胞置于DMEM培养基(含有10%胎牛血清+1%青霉素和链霉素双抗)中，37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，每2～3 d更换一次培养液，细胞融合至80%后，采用胰蛋白酶消化、传代，选取对数生长期细胞作为实验对象。

1.2.2 Western blot法检测MeCP2在HOK、CAL27细胞系中的蛋白表达量 取HOK、CAL27对数期细胞，加入预冷RIPA细胞裂解液，注入离心管，以10000 r/min，离心半径r=10 cm离心15 min，BCA法测定蛋白含量。取50 μg待测蛋白，按比例与上样缓冲液混合，经水煮沸5 min，同条件离心取其上清，80 V恒压上样电泳后湿转至硝酸纤维素膜，封闭液室温摇床封闭2 h，TBST清洗，加入兔抗人MeCP2一抗(1∶500)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，TBST清洗，加入ECL发光液显色，暗室曝光，经一体式凝胶成像系统分析，以MeCP2蛋白与内参GAPDH灰度值比值表示蛋白表达量。

1.2.3 细胞干预、转染、分组[5]取对数期CAL27细胞，PBS洗涤，调整细胞密度为1×105个/mL，接种至6孔板，待细胞再次融合至60%时，分为空白组、橙皮苷组、MeCP2过表达组、橙皮苷+MeCP2过表达组。空白组不处理，橙皮苷组培养基加入橙皮苷(100 μmol/L终浓度)，MeCP2过表达组根据LipofectamineTM3000试剂盒说明书步骤，转染MeCP2蛋白过表达质粒pcDNA 3.1-MeCP2，橙皮苷+MeCP2过表达组转染pcDNA 3.1-MeCP2后，加入橙皮苷(100 μmol/L终浓度)。每组设置5个复孔，干预或转染48 h后进行后续实验。

1.2.4 Western blot法检测各组MeCP2蛋白表达量 取各组细胞，操作同1.2.2。

1.2.5 平板克隆实验检测各组克隆能力 转染48 h后，取各组细胞经胰蛋白酶消化、传代，吹打为单个细胞，以细胞密度300个/mL接种于培养皿中(含培养液10 mL)，置于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养，每2～3 d更换一次培养液，待出现肉眼可见的克隆细胞时，终止培养。弃其上清液，PBS洗涤干净，加入4%多聚甲醛4 ℃固定15 min，弃去固定液，PBS洗涤，加入结晶紫染液37 ℃染色25 min，自来水冲洗，风干，将平皿倒置于透明胶片上，低倍镜下记录克隆数并拍照。

1.2.6 划痕实验检测各组迁移能力 取各组对数期细胞，经胰蛋白酶消化、重悬。以1×106个/mL接种至6孔板，培养至细胞贴壁，吸去培养基，用移液器枪头沿孔板中央垂直向下画一条直线，PBS轻吹除去边缘细胞碎片，置于完全培养基继续培育24 h，置于显微镜下拍照记录培养前划痕宽度及培育24 h后划痕宽度，观察细胞迁移情况，计算各组迁移率。迁移率=(培养前划痕宽度-培育24 h后划痕宽度)/培养前划痕宽度×100%。

1.2.7 Transwell实验检测各组侵袭能力 取Matrigel胶冰浴融化，加入PBS稀释，以50 μL/孔置于Transwell小室滤膜上，取各组OSCC CAL27细胞，调整细胞密度为5×105个/mL，接种于Transwell小室上层，下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养箱中培养48 h，取出杯底滤膜，PBS冲洗，加入0.25%戊二醛固定15 min，加结晶紫染液37 ℃染色25 min，自来水冲洗，风干。显微镜下随机选取5个视野，拍照并记录各视野穿模细胞数，取其均值。

1.2.8 Western blot法检测Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表达量 取各组细胞。同1.2.2洗涤、裂解、定量、变性、电泳、转膜、孵育。分别加入相应抗体Wnt-1、β-catenin、APC一抗(1∶500)，4 ℃摇床孵育过夜，TBST清洗，加入二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h，TBST清洗，加入ECL发光液显色，暗室曝光，经一体式凝胶成像系统分析，以目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值表示目的蛋白表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 MeCP2在HOK、CAL27细胞系中的蛋白表达量

HOK、CAL27细胞系中MeCP2蛋白表达量分别为(0.43±0.03)、(0.61±0.05)，与HOK细胞系比较，MeCP2在CAL27细胞系中蛋白表达量升高(t=6.903，P<0.05)。见图1。

图1 Western blot法检测HOK、CAL27细胞系中MeCP2蛋白表达量

2.2 转染后MeCP2蛋白表达量

转染48 h后，空白组、橙皮苷组、MeCP2过表达组、橙皮苷+MeCP2过表达组MeCP2蛋白表达量分别为(0.63±0.06)、(0.24±0.02)、(0.94±0.09)、(0.41±0.04)，与空白组比较，橙皮苷组MeCP2蛋白表达量降低，MeCP2过表达组MeCP2蛋白表达量升高(P<0.05)；与橙皮苷组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组MeCP2蛋白表达量升高(P<0.05)；与MeCP2过表达组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组MeCP2蛋白表达量降低(P<0.05)。见图2。

图2 Western blot法检测各组MeCP2蛋白表达量

2.3 克隆能力比较

空白组、橙皮苷组、MeCP2过表达组、橙皮苷+MeCP2过表达组克隆数分别为(203.00±29.93)个、(74.50±10.52)个、(285.00±35.41)个、(122.50±19.97)个，与空白组比较，橙皮苷组克隆数减少，MeCP2过表达组克隆数增加(P<0.05)；与橙皮苷组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组克隆数增加(P<0.05)；与MeCP2过表达组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组克隆数减少(P<0.05)。见图3。

图3 平板克隆实验检测克隆能力

2.4 迁移能力比较

空白组、橙皮苷组、MeCP2过表达组、橙皮苷+MeCP2过表达组迁移率分别为(71.88±8.23)%、(51.67±5.37)%、(90.36±9.52)%、(64.44±6.74)%，与空白组比较，橙皮苷组迁移率降低，MeCP2过表达组迁移率升高(P<0.05)；与橙皮苷组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组迁移率升高(P<0.05)；与MeCP2过表达组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组迁移率降低(P<0.05)。见图4。

图4 划痕实验检测迁移能力(×100，标尺50 μm)

2.5 侵袭能力比较

空白组、橙皮苷组、MeCP2过表达组、橙皮苷+MeCP2过表达组侵袭细胞数分别为(70.40±7.60)个/视野、(13.40±3.80)个/视野、(124.60±13.80)个/视野、(38.20±4.40)个/视野，与空白组比较，橙皮苷组侵袭细胞数减少，MeCP2过表达组侵袭细胞数增加(P<0.05)；与橙皮苷组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组侵袭细胞数增加(P<0.05)；与MeCP2过表达组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组侵袭细胞数减少(P<0.05)。见图5。

图5 Transwell实验检测侵袭能力(×200，标尺200 μm)

2.6 Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表达比较

与空白组比较，橙皮苷组Wnt-1、β-catenin蛋白表达降低、APC蛋白表达升高，MeCP2过表达组Wnt-1、β-catenin蛋白表达升高，APC蛋白表达降低(P<0.05)；与橙皮苷组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组Wnt-1、β-catenin蛋白表达升高，APC蛋白表达降低(P<0.05)；与MeCP2过表达组比较，橙皮苷+MeCP2过表达组Wnt-1、β-catenin蛋白表达降低、APC蛋白表达升高(P<0.05)。见表1，图6。

图6 Western blot法检测各组Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表达

表1 各组细胞Wnt-1、β-catenin、APC蛋白表达

3 讨论

OSCC是源自口腔黏膜的鳞状细胞癌，早期通常表现为表浅溃疡，逐渐出现病理性白斑、红斑，进而进展为肿瘤侵入口腔内部组织[6],其危险因素包括不良生活习惯，如吸烟、饮酒、食用槟榔、感染HPV等[7]。目前关于OSCC的发病机制尚不明确，研究认为其与基因突变、微小RNA调控、抑癌基因产物改变DNA代谢调节有关[8]。恶性程度高、病程发展快、侵袭性强、复发率高是OSCC的主要特征，且多数患者确诊时已出现淋巴结转移，是高复发率和病死率的重要原因[9]。由此可见，研究抑制OSCC细胞克隆、侵袭、迁移等恶性细胞学行为的方式，是提升患者生存率，改善预后的有效途径。

近年来，天然提取物常被用于抗癌治疗，因其高效、低副作用的特点，已成为临床研究热点。橙皮苷广泛存在于柑橘属、芸香科、茜草科、十字花科植物果实或根茎中，具有抗炎、抗衰老、提升免疫力、保护心脑血管、防止血液凝聚及抗癌等多种生物学活性[10]。L等[11]在研究橙皮苷的抗癌活性及其作用机理时发现，其可抑制体外人前列腺癌细胞活力，阻滞细胞周期，促进其凋亡，并降低其迁移、侵袭能力，提示其具有潜在的体外抗癌作用。作为天然抗氧化保健品，橙皮苷及其衍生物可清除超氧阴离子自由基，减少DNA损伤，降低肿瘤发生风险[12]。本研究结果显示，与空白组比较，橙皮苷组克隆数、侵袭细胞数减少，迁移率降低，提示橙皮苷可抑制OSCC细胞克隆、侵袭、迁移。

DNA甲基化是引发抑癌基因失活的重要原因之一[13]。MeCP2蛋白是甲基化结合蛋白家族成员，可与甲基化DNA结合或经转录因子识别甲基化DNA，进而调控其下游蛋白表达，参与增殖、侵袭、迁移、凋亡等多种细胞功能调控[14]。有研究表明[15]，MeCP2在乳腺癌细胞中异常高表达，敲降MeCP2可抑制细胞增殖，阻滞细胞周期并诱导其凋亡。Wnt/β-catenin信号通路是引发肿瘤的重要通路之一，其中Wnt1表达水平与该信号通路活性有关。APC是一种抑癌基因，其蛋白参与β-catenin浓度调控。正常细胞内β-catenin与APC结合呈低表达状态。肿瘤细胞内，APC基因缺失或突变，β-catenin大量游离，进入核内参与调控基因表达，诱发Wnt/β-catenin信号通路异常激活[16]。Zhang等[17]研究认为，MeCP2高表达可激活Wnt/β-catenin信号传导途径来促进OSCC细胞增殖，促进OSCC发展。本研究结果显示，与HOK细胞系比较，CAL27细胞系MeCP2蛋白表达量升高，提示MeCP2在OSCC细胞异常低表达；与空白组比较，MeCP2过表达组Wnt-1、β-catenin蛋白表达升高，APC蛋白表达降低，且与橙皮苷联用可减弱转染MeCP2对OSCC恶性行为的影响，提示橙皮苷抑制OSCC细胞克隆、侵袭、迁移的机制可能与调控MeCP2，进而调控Wnt/β-catenin信号通路有关。

综上所述，橙皮苷可抑制OSCC细胞克隆、侵袭、迁移，其作用机制可能与抑制MeCP2，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路有关。