miR-95和miR-19b在骨肉瘤组织中的表达及与顺铂耐药性的关系

雷小蕾 刘建峰 叶铁良 张帅虎 袁国静

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，约占所有儿科恶性肿瘤的2.4%[1]。骨肉瘤患者常用的化疗药物包括顺铂、阿霉素和甲氨蝶呤，但化疗药物耐药情况也越发普遍[2]。化疗药物顺铂(cisplatin，CDDP)在临床上主要用于实体瘤的治疗，它抗癌谱广，是目前已知的最有效的抗肿瘤药物之一，也是骨肉瘤化疗的一线用药[3]。然而临床上在使用顺铂化疗的过程中，患者易产生耐药，这可能与药物的不规范使用、肿瘤细胞基因的不稳定性及高突变率等有关[4]。但是关于临床治疗中骨肉瘤化学耐药性的分子机制尚不清楚。miRNA(microRNA)是一类由内源性基因编码的非编码单链 RNAs，长度约为 22 个核苷酸，主要在翻译水平调控基因的表达[5]。miRNA 在肿瘤耐药中发挥着重要作用，其在耐药细胞和对药物敏感的细胞中的表达量存在差异[6]。miR-95和 miR-19b 与多种类型肿瘤的发生高度相关[7]，但是与骨肉瘤以及顺铂耐药性的关系尚不明确。因此本研究探讨miR-95和 miR-19b 在骨肉瘤组织中的表达及与顺铂耐药性的关系，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2016年2月至2020年2月本院收治的骨肉瘤患者100例，其中男性54名，女性46名，年龄6～69岁。纳入标准：①符合《骨肉瘤临床循证诊疗指南》[7]，经病理学确诊骨肉瘤；②病历、临床资料完整；③患者签署自愿受试同意书，患者及其家属需签署知情同意书。排除标准：①精神疾病患者；②合并其他恶性肿瘤患者；③合并其他器官严重性病变患者；④排除糖尿病、肾病等其他代谢性疾病的患者。

1.2 miR-95和 miR-19b 水平检测

取骨肉瘤组织样本，使用TRIzol RNA试剂盒(购自赛默飞世尔科技有限公司)提取总RNA，紫外分光光度计(上海美谱达公司)检测总RNA 浓度及纯度。取 2 μg 总 RNA 使用反转录试剂盒(赛默飞世尔科技有限公司)进行反转录反应。取反转录产物进行PCR扩增，用2-ΔΔCt法计算各组基因的相对表达量。

1.3 化疗耐药分析

患者可根据铂类耐药评价标准[8]分为敏感组和耐药组，敏感组为患者在化疗完成后处于完全缓解状态，后期复发间隔6个月以上；耐药组为患者在化疗完成后处于症状未缓解状态或者处于完全缓解状态但是后期复发间隔在6个月以内。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 miR-95和 miR-19b 表达与骨肉瘤患者的临床病理参数关系分析

根据结果发现，miR-95和 miR-19b表达与性别无关(P均>0.05)，与临床分期、肿瘤直径以及远处转移有关(P均<0.05)，其中临床分期Ⅲ期、肿瘤直径≥5 cm、发生远处转移患者miR-95表达水平显著低于其他患者(P<0.05)，临床分期Ⅲ期、肿瘤直径≥5 cm、发生远处转移患者miR-19b 表达水平显著高于其他患者(P<0.05)，见表1。

表1 miR-95和 miR-19b表达与骨肉瘤的临床病理资料关系

2.2 miR-95和 miR-19b表达与化疗耐药的关系

miR-95在耐药组的表达水平明显低于敏感组，差异有统计学意义(P<0.05)；miR-19b在耐药组的表达水平明显高于敏感组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 miR-95和 miR-19b在耐药组与敏感组中的表达水平

2.3 miR-95和miR-19b对骨肉瘤患者化疗耐药的预测价值分析

根据ROC曲线分析可知，miR-95和miR-19b评估骨肉瘤患者化疗耐药的预测AUC分别为0.707、0.692，联合检测AUC为0.808，高于单独检测的AUC值。见表3，图1。

表3 miR-95和 miR-19b联合检测骨肉瘤预测效能评价

图1 miR-95和 miR-19b对骨肉瘤化疗耐药的预测价值ROC曲线分析

3 讨论

骨肉瘤是高度恶性的间叶组织肿瘤，年发病率约为3/100万，由于骨肉瘤局部侵袭性生长并易发生远处转移[9-10]。与其他癌症类型相比，骨肉瘤的分子发病机制尚不清楚。骨肉瘤患者的5年总体和无病生存率为50%～60%，约40%的患者死于肺转移[11]。近年来，顺铂的新辅助化疗被广泛用于降低骨肉瘤患者的复发率和提高生存率[12]。对化疗药物的耐药性仍然是骨肉瘤和癌症治疗的主要问题。目前临床上对化疗耐药的评价标准主要根据患者在化疗结束后根据化疗效果以及复发情况来判断，不能及时根据耐药情况调整治疗药物，影响患者的治疗效果，因此寻找有效的针对子宫内膜癌化疗耐药情况的生物学指标对临床研究具有重大意义。

miRNA 是一种高度保守的非编码RNA分子，具有18～25个核苷酸，在转录后调节基因表达[13]。miRNA参与多种细胞过程，如分化、增殖和凋亡，这些过程在癌症的发展中具有重要意义，越来越多的研究表明miRNA可能与癌症的发生和发展密切相关[14-15]。miR-95过表达促进了肿瘤生长[16]。研究表明miR-19b可以促进乳腺癌细胞的肿瘤发生[17]。有研究称与正常黑色素细胞相比，黑色素瘤细胞中miR-19b的表达显着增加[18]。在骨肉瘤细胞中也发现了miR-19b的上调表达，并在这种恶性肿瘤中发挥了促癌作用[19]。但是miR-95和miR-19b在骨肉瘤的发病机制和化疗耐药中的潜在作用尚未阐明。本研究结果显示：miR-95和miR-19b表达与临床分期、肿瘤直径以及远处转移有关，提示了miR-95和miR-19b可能参与了骨肉瘤的发生发展，但是具体发病机制亟待进一步研究。miR-95在耐药组的表达水平明显低于敏感组，miR-19b在耐药组的表达水平明显高于敏感组。miR-95和miR-19b评估骨肉瘤患者化疗耐药的预测AUC分别为0.707、0.692，联合检测AUC为0.808，高于单独检测的AUC值。说明miR-95和miR-19b水平与骨肉瘤对化疗耐药有关，与目前的研究所推测的一致，另外还发现其对骨肉瘤化疗耐药有一定的预测价值，可作为骨肉瘤化疗耐药相关生物标志物的潜力。

综上所述，本研究证实了miR-95和miR-19b与骨肉瘤病理参数的关系以及对化疗耐药预测的价值，为未来寻求一种有效与骨肉瘤相关的生物标志物提供了数据基础。然而本研究由于样本量少以及中心单一等不足对研究结果可能产生一定的偏移，在未来的研究中需要更具前瞻性以及扩大样本量来对结果进一步完善。