基于双向电泳与质谱联用的牛羊乳蛋白质组比较

宋宏新，刘晓凤，程妮，薛海燕

（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，西安 710021；2.深圳普门科技股份有限公司，深圳 518108）

0 引言

牛乳和羊乳是世界产量最大的两类乳源[1]，对其成分与功能的研究历来没有间断，两者的差异造成了消费者选择上的困扰。蛋白质是乳中重要的营养物质之一，其含量大、种类多，是牛羊乳区别检测的主要目标物质[2]。羊乳还包括绵羊乳与山羊乳两大类，两者蛋白质组成亦存在差异，国内羊乳以山羊乳为主，因此本文以山羊乳（文中羊乳皆指山羊乳）为研究对象，与牛乳的蛋白质组进行了比较研究。

利用蛋白质组学（proteomics）方法可对组织或系统的全部蛋白的表达模式与功能模式进行研究[3]，等电聚焦(IEF)和SDS-PAGE结合的双向凝胶电泳技术(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)[4-5]是最常用的蛋白组分析技术，该技术广泛应用到了生物学及食品等研究领域[6-9]。已有报道利用蛋白质组学技术来鉴定乳中蛋白种类、蛋白含量并对蛋白质功能进行分析等[10]。Lee[11]等使用2-DE图谱结合MALDITOF MS技术对牛初乳进行蛋白质组分析，鉴定出了白蛋白、乳铁蛋白、血清白蛋白前体、胰蛋白酶抑制剂等已知的蛋白，此外还鉴定了许多未知的乳清蛋白。Yang[12]等使用2-DE技术结合质谱法来检测牛乳中植物蛋白掺假，根据掺假牛乳凝胶上特有的蛋白质斑点可知，在掺杂大豆蛋白的牛乳中检测到β-大豆球蛋白和大豆球蛋白，而在掺杂豌豆蛋白的牛乳中检测到豌豆球蛋白，在掺杂小麦蛋白的牛乳中检测到β淀粉酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂。陈静廷[13]等利用2-DE技术分析pH 4.6与pH 4.8沉淀酪蛋白后的牛乳清样品，结果显示pH 4.6时提取的乳清样品2-DE图谱中存在124个蛋白点，pH 4.8时有127个蛋白点，结合图谱清晰度及蛋白点分离效果可得pH 4.6酪蛋白沉淀提取法更适用于牛乳清样品的制备。双向凝胶电泳蛋白质组结合质谱鉴定技术可以较好的分离蛋白并对其种类进行鉴定，本研究便基于该技术对鲜牛羊乳中的蛋白质组进行全面系统的比较，并探讨牛羊乳的潜在生物学功能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料

鲜牛乳与鲜羊乳分别由陕西西安草滩奶牛场与金牛乳业有限公司提供，乳样采集后密封，-80℃冰箱中保存备用。

1.1.2 试剂

3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐CHAPs，昂飞公司；碘乙酰胺IAA、硫脲，美国Amersham公司；PMSF（蛋白酶抑制剂）、DTT（二硫苏糖醇），美国Amresco公司；固相pH梯度干胶条(pH4～7,24 cm)、IPG缓冲液(pH4～7)，伯乐生命医学产品(上海)有限公司；胰酶，普洛麦格(北京)生物技术有限公司；HCCA(基质)，美国应用生物系统公司；中分子量标准蛋白质、牛血清标准品BSA，美国Sigma公司。

1.1.3 仪器与设备

GE Ettan IPGphor 3等 电 聚 焦 仪、GE Ettan DALTsix双向电泳系统，美国通用电气公司；UMAX Powerlook1100扫描仪，力广科技股份有限公司；Ultraflex III TOF/TOF质谱仪，美国Bruker Daltonic公司。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

新鲜牛羊乳于4℃，5 000 r/min离心30 min，弃去上层脂肪，得脱脂牛羊乳[14]，取部分脱脂牛羊乳用1 mol/L HCl调pH至酪蛋白等电点(牛乳pH4.6，羊乳pH4.1)，静置30 min后4℃，5 000 r/min，离心30 min取上清即为牛羊乳清。对脱脂牛羊乳和乳清进行冷冻干燥，并保存于-80℃下备用。

1.2.2 双向电泳分析

第一向等电聚焦(IEF)，分别取脱脂牛羊乳及牛羊乳清冻干粉20 mg，各加入200μL再水化液RB(7 mol/L尿素、4%CHAPs、2 mol/L硫脲，双蒸水溶解)充分混合溶解，在4℃下12 000 r/min离心20 min取上清液（即为样品液），用考马斯亮蓝染色法定量测定。IEF采用固相pH梯度干胶条，根据蛋白质定量结果取样，硝酸银染色的分析胶上样量为40μg，而考马斯亮蓝染色的质谱胶上样量为500μg。上样液的成分为：样品液、1%IPG缓冲液、1%DTT、1×溴酚蓝缓冲液、RB至460μL[15]。室温20℃泡胀过夜（10～12 h），使胶条完全吸收上样液。等电聚焦程序[16]为：300V 0∶30Hr，500V 1∶00Hr，1 000V 1∶00Hr，8 000V 3∶00Hr，8 000V 5∶20Hr，聚焦电压：58kVh。

第二向SDS-PAGE，胶条复温并进行平衡，先用100 mmol/L DTT的SDS平衡液平衡15 min，再用250 mmol/L IAA的SDS平衡液避光平衡15 min。SDS-PAGE凝胶浓度为12.5%，上样与电泳方法参照Qin[17]等的方法。电泳结束后对凝胶分别进行银染或者考染，扫描银染胶，图像用ImageMaster 2D platinum 5.0软件分析。

1.2.3 质谱前处理、质谱分析鉴定及生物信息学分析

在质谱（考染）胶上挖出需鉴定的点，对胶粒进行洗涤、脱色、脱水、干燥、胰酶（1μg/μL）酶切[2]，将提取的肽段用质谱仪进行质谱分析。质谱条件为：UV波长355 nm；重复速率200 Hz；加速电压20 000 V；最优质量分辨率1 500 u；扫描质量范围700～3 200 u；采用仪器默认模式获得质谱图，胰酶自切峰为内标校正质谱仪，基线峰过滤、信号峰识别用flexAnalysis（Bruker Dalton）软件进行。搜索NCBI数据库查找相关蛋白质进行匹配鉴定，搜索UniPort蛋白质数据库（http://www.uniprot.org/），将鉴定成功的蛋白质信息转换为基因名称，然后利用mas3.0分子功能注释系统（http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/）进行GO注释并分析。

2 结果与讨论

2.1 脱脂牛羊乳2-DE图谱分析

2.1.1 2-DE图谱分析

脱脂牛羊乳2-DE图谱如图1所示，主要酪蛋白集中在25～40 ku，主要乳清蛋白分布在15 ku处，此外还有许多低丰度蛋白点。将牛羊乳中所有蛋白点置于一张坐标图上进行比较，如图2所示，由图可知牛羊乳蛋白整体分布差异不明显，在羊乳中共发现659个蛋白点，牛乳中592个，其中酪蛋白与清蛋白的点数之和占脱脂乳总蛋白的60%左右，蛋白含量占70%以上。牛羊乳蛋白的分子量均处于0～160 ku，其等电点分布于4～7。Minh[18]等曾采取pH 3～10的IPG胶条对牛羊乳进行分析显示大多蛋白仍分布于pH 4～7之间，与本实验结果相同。

图2 脱脂牛羊乳蛋白点分布

在银染胶的酪蛋白区域选择清晰且牛羊乳中差异较大的蛋白点（见图1，图中选取的牛乳酪蛋白斑点标注为b1～b10；羊乳酪蛋白斑点标注为g1～g11），并在考染胶上对应位点挖出对应蛋白点进行质谱鉴定。

图1 脱脂牛羊乳2-DE图谱

2.1.2 脱脂牛羊乳蛋白分布特点

对脱脂牛羊乳2-DE图谱中所有蛋白点分布进行分析，结果如图3与图4所示。图3中分子量处于0～20 ku时牛乳的蛋白点数与含量均低于羊乳，乳清蛋白主要分布于此区域。分子量为20～40 ku时牛乳中蛋白点数及含量略高于羊乳，且酪蛋白多分布于此区域。在40～160 ku分子量区域内存在多种低丰度蛋白，且牛乳蛋白点数略低于羊乳而蛋白含量高于羊乳。结合图4可知，当等电点为0～5时牛乳蛋白点数及含量均高于羊乳；而等电点为5～7时牛乳蛋白点数及含量低于羊乳，因此，从整体来看牛乳蛋白等电点低于羊乳。刘鸣畅[19]等人采用双向电泳技术对牛羊乳蛋白进行分析，表明牛羊乳中αs1-CN与β-CN的等电点基本相同，但牛乳αs2-CN的等电点小于羊乳；在乳清蛋白中牛乳β-LG的等电点也小于羊乳，且两者α-乳白蛋白的等电点基本相同，与本研究的结果类似。

图3 脱脂牛羊乳蛋白分子量分布

图4 脱脂牛羊乳蛋白等电点分布

2.1.3 牛羊乳主要酪蛋白图谱比较

对占乳蛋白质80%以上的酪蛋白进行了质谱鉴定比较研究。乳酪蛋白主要有αs1-CN（区域A）、αs2-CN（区域B）、β-CN（区域C）、κ-CN（区域D）4类（比较如表1，在双向电泳中的位置见图1中的标注），其在2-DE图谱中电泳行为存在一定差别。由表1可知，区域A处牛羊乳αs1-CN的等电点相同，而牛乳中分子量稍大于其在羊乳中的分子量，且蛋白点相对含量差别较大，牛乳为11.0%，羊乳为3.8%；区域B中牛羊乳αs2-CN也存在较大差异，羊乳中此类蛋白为一系列横向排列的点，蛋白质磷酸化修饰可能导致了其等电点的不同，Olumee[20]等发现羊乳αs2-CN中含有2个多磷酸肽和10个磷酸化位点，在等电聚焦过程中磷酸基团不断解离使蛋白质聚焦于不同的pH，而牛乳αs2-CN分布较为集中，相对含量为8.9%，高于羊乳中的3.3%；区域C中牛乳β-CN的相对含量为14.3%，羊乳为21.8%，两者在电泳行为上无明显差异[21]，而Costa[22]等认为萨能羊与高山羊2-DE图谱中B区域一系列横向排列的点为β-CN，C区域为αs2-CN；区域D主要分布的为κ-CN，牛乳κ-CN的等电点及蛋白点数较羊乳偏高，根据文献显示[23]，牛乳所有酪蛋白中只有κ-CN是糖基化的，因此磷酸化修饰及聚合程度的不同造成了牛羊乳κ-CN的差异。

表1 牛羊乳2-DE图谱酪蛋白种类比较

2.2 牛羊乳清2-DE图谱分析

2.2.1 2-DE图谱分析

牛羊乳清2-DE图谱如图5所示，在牛乳中检测到628个蛋白点，羊乳中650个，由图可知在25～40 ku的酪蛋白区间仍含有少量蛋白斑点，但其含量甚微。图中蛋白点大多分布于凝胶下方20 ku以下低分子量区间和上方40 ku以上的高分子量区间，其中低分子量区域主要分布乳清蛋白，高分子量区域主要分布牛羊乳低丰度蛋白。乳清蛋白主要包括β-LG（E区域）和α-LA（F区域），低丰度蛋白主要为一些酶类及活性蛋白成分[24]。在牛羊乳银染胶上选择清蛋白点（见图5，牛乳清蛋白斑点标注为b11～b16；羊乳清蛋白斑点标注为g12～g15）和低丰度清蛋白（图5中牛乳清低丰度蛋白斑点标注为b17～b26；羊乳清低丰度蛋白斑点标注为g16～g24），并在考染胶上对应位点挖出对应蛋白点进行质谱鉴定。

图5 牛羊乳清蛋白2-DE图谱

2.2.2 牛羊乳主要清蛋白图谱比较

牛羊乳清蛋白主要有β-LG（区域E）、α-LA（区域F），此外乳清中还有低丰度蛋白如血清白蛋白（区域G）（比较如表2，在双向电泳中的位置见图5中的标注）。牛乳α-LA的等电点略低于羊乳，蛋白点数与位置基本相同，因此牛羊乳α-LA无明显差异。然而牛羊乳β-LG的双向电泳行为存在显著差别，牛乳β-LG斑点比羊乳β-LG更靠近酸性端，显示牛乳β-LG的等电点低于羊乳，分子量与蛋白点数无明显差别。血清白蛋白BSA处于70 ku分子量处，且牛羊乳中该蛋白电泳行为无明显区别。

表2 牛羊乳2-DE图谱清蛋白种类比较

2.3 牛羊乳蛋白质谱鉴定

2.3.1 牛羊乳酪蛋白质谱鉴定

在脱脂牛羊乳考染胶上挖出选定的酪蛋白质斑点（图1标示：b1～b10牛乳10个蛋白点，g1～g11羊乳11个蛋白点）进行质谱鉴定，其中主要差异酪蛋白斑点的质谱图如图6所示，可知肽段离子峰主要集中在750～2 500 m/z之间，且此类蛋白的匹配肽段数在2～2之间，匹配比率为11%～42%，牛羊乳中均鉴定出αs1-CN（b1～b3，g1～g2）、αs2-CN（b4，g5～g8）、β-CN（b10，g3～g4，g11）、κ-CN（b5～b9，g9～g10）4类酪蛋白。

图6 牛羊乳主要差异酪蛋白点质谱图

搜索数据库得到的蛋白理论等电点与分子量见表3，结合表1中各蛋白点所处区域pH范围及分子量位置可知，牛羊乳中酪蛋白种类基本相同，但质谱鉴定出的4类酪蛋白的理论分子量和等电点与图谱中显示的分子量和等电点存在差异，且牛羊乳中同种类蛋白的等电点也不相同，其原因可能为牛羊乳中同种蛋白质的氨基酸序列不同，不同的研究者鉴定该蛋白分子量与等电点的方法不同，且蛋白所处环境也可能不同，这些研究者的成果共同构成了数据库中该蛋白的理论等电点和分子量[25]。

表3 牛羊乳酪蛋白点质谱鉴定信息

2.3.2 牛羊乳清蛋白质谱鉴定

在牛羊乳清蛋白考染胶上挖出选定的清蛋白质斑点进行质谱鉴定，选择牛乳清蛋白点6个（图5标示：b11～b16）、羊乳清蛋白点4个（图5标示：g12～g15），主要差异清蛋白点的质谱图见图7，肽段离子峰主要分布在800～2 900 m/z之间，此类蛋白的匹配肽段数在3～9之间，匹配比率为19%～55%，鉴定结果显示出β-LG（b11～b13，b15～b16，g15）、α-LA（b14，g12～g14）两类清蛋白。b11～b13，b15～b16蛋白质点的理论等电点与分子量分别为4.93和20 269 u；b14的为4.80和16 692 u；g15的为5.50和20 362 u；g12～g14的为5.06和16 700 u，结合表2可知，清蛋白在图谱中显示的等电点接近于理论等电点，显示的分子量略小于理论分子量。同时在羊乳清2-DE图谱区域E的左侧存在一系列纵向排列的α-LA斑点（区域H），而牛乳清2-DE图谱中不存在此类斑点，因此可用于区别牛羊乳。

图7 牛羊乳主要差异清蛋白点质谱图

2.3.3 牛羊乳低丰度清蛋白质谱鉴定

在牛羊乳清蛋白考染胶上端挖出选定的低丰度清蛋白斑点（牛乳10个b17～b26、羊乳9个g16～g24）进行质谱鉴定，结果显示在牛乳中共鉴定出10种蛋白质，羊乳中6种。其中丝氨酸蛋白酶系列（b17～b19,g17～g18）、补体成分3（点b23，g20～g21）、血清铁传递蛋白（b25，g24）与聚免疫球蛋白受体（b26，g22～g23）在牛羊乳中均可鉴定出。Lu[26]等表明补体蛋白在山羊乳中的表达量高于其在牛乳中的含量。此外多种活性蛋白成分也在牛羊乳清中被鉴定出，如牛乳中的维生素D结合蛋白（b20）、α-1-抗糖蛋白（b21）、锌-α-2-糖蛋白（b22）以及位于图谱100 ku处的IgM重链恒定区（b24），而与牛乳丝氨酸A3-2（b17）对应位置的羊乳清图谱中鉴定的蛋白为α-2-HS-糖蛋白（g16），与牛乳锌-α-2-糖蛋白（b22）和IgM重链恒定区（b24）对应的分别为羊乳α-心肌1（g19）和聚免疫球蛋白受体（g22～g23）。因此牛羊乳中低丰度清蛋白种类繁多且不同，该类蛋白均可作为牛羊乳区别检测的靶点。

2.4 牛羊乳蛋白生物信息学分析

对鉴定成功的15种牛乳蛋白与12种羊乳蛋白进行基因注释，主要可分为分子功能（Molecular Function）、生物学途径（Biological Process）和细胞组件（Celluar Component）3个层面，注释结果如图8、图9、图10所示。

图8为分子功能层面上的比较。鉴定出的牛乳蛋白中检测到的功能有黏附功能、转运活性、分子功能监管、抗氧化活性、转移酶的活性等5类，其中有11种蛋白参与黏附功能，是蛋白参与最多的一种功能。而羊乳中检测到了黏附功能、转运活性、催化活性、酶调节活性、聚合物免疫球蛋白受体活性和受体活性等6类功能，且参与各种功能的蛋白种类相近。李春强[27]等研究发现黏附功能可以使蛋白质与其他物质结合，形成结合蛋白，从而拓展蛋白功能，若其与抗原结合便可激活补体，促进吞噬作用。

图8牛羊乳蛋白GO注释（分子功能）

图9 为生物学途径层面上的比较。牛乳蛋白参与的生物学途径有14类，以生物调节、刺激反应、定位、细胞过程、个体组织过程、代谢过程等为主。而羊乳蛋白参与的生物学途径有11类，与牛乳相比多了受体集群与病毒反应两种途径，少了免疫系统过程、应对其他生物体、组织或生物起源细胞组件、抗氧化活性和细胞黏附5种途径。张熙桐[28]等研究表明母乳、牛乳及羊乳3种乳中的清蛋白均在生物调节过程中发挥最大作用，其次为对刺激的反应，且母乳中参与各种生物学途径的蛋白种类数高于牛羊乳。

图9牛羊乳蛋白GO注释（生物学途径）

图10 为细胞组件层面上的比较。牛乳蛋白中检测出的细胞组件包括细胞外区域、细胞、细胞器、细胞组分、高尔基腔、细胞器组分、膜、蛋白质复合体等10类，羊乳蛋白中未测到细胞、高尔基腔与膜，但检测到了膜的有机组成部分和细胞核两类。叶清[29]等研究显示在乳的细胞组件中，胞外区所占比例最大，在此区域会发生一系列细胞激活反应，也是大量分子发生结合的重要区域。

图10 牛羊乳蛋白GO注释（细胞组件）

目前对牛羊乳蛋白质的研究一般采用蛋白质组分析方法对总蛋白样品进行研究，期望获得更多种类的蛋白质信息，如翁秀秀[30]等利用双向电泳技术探究不同泌乳期湖羊脱脂乳蛋白质组特征，以第一天初乳的2-DE图谱为参照，分别在第3天、第7天、第14天、第28天、第56天检测到了38、35、34、38、36个差异蛋白点，然而由于脱脂牛羊乳中酪蛋白含量占乳中总蛋白质的80%以上，致使许多低丰度清蛋白不被检出，酪蛋白和较高含量的清蛋白作为乳中重要的储藏蛋白，它们对乳品加工特性及营养价值起决定性作用[31]。本研究采用等电点沉淀法去除酪蛋白的乳清样品进行电泳分析，有利于大量低丰度乳清蛋白的检出，清蛋白大多为具有生物活性的球蛋白，对其功能分析有利于探寻产乳动物的泌乳及生理特性[32]，其中一些蛋白还可以反映出乳腺的健康状况。但由于该类蛋白含量低、易变性的特点[33]，使得进行蛋白组研究的重复稳定性较差，本实验采取低温冷冻干燥制样，使得实验结果重复性较好。Yang[34]等利用相对和绝对定量(iTRAQ)技术分析牛乳、耗牛乳、水牛乳、山羊乳与骆驼乳的乳清蛋白质组，结果显示共鉴定出211种蛋白质，并分析了不同种类乳蛋白质组学模式差异的显著性，揭示了各物种的特征清蛋白，为评估上述乳品掺假提供了信息，然而此种方法只从蛋白种类与含量上分析了其差异，并未显示其性质差异，因此本研究采用双向电泳技术分离乳蛋白，然后用质谱鉴定并搜索数据库得出各蛋白的分子结构信息差异。本研究在牛羊乳离心脱脂过程中弃去了脂肪成分，其含有的乳脂肪球膜蛋白有待后续研究完善，对牛羊乳的蛋白质组分析为牛羊乳蛋白质的深入比较及掺假靶标研究奠定了基础。

3 结论

通过双向电泳技术在脱脂牛乳中检测到了595个蛋白点，脱脂羊乳中659个，牛乳清中628个，羊乳清中650个，脱脂牛羊乳中主要蛋白种类基本相似，但在2-DE图谱中所处的位置却不相同，主要是由于分子量与等电点存在差异，牛乳清与羊乳清的鉴定结果也类似。其中αs1-CN、αs2-CN、κ-CN及β-LG在2-DE图谱中区别较大，牛乳中αs1-CN含量为11.0%,，远高于羊乳的3.8%；牛乳中αs2-CN含量为8.9%，也高于羊乳中含量；牛乳κ-CN等电点为4.7～5.7，高于其在羊乳中等电点；牛乳β-LG的等电点为4.0～5.0，明显高于其在羊乳中等电点，因此这4类蛋白可作为牛羊乳掺假的指示蛋白。通过质谱分析确定了牛羊乳酪蛋白与清蛋白的分子结构信息以及理论等电点与分子量，同时多种低丰度蛋白也在乳清中被鉴定出，如牛乳中特有的维生素D结合蛋白、丝氨酸蛋白酶及α-1-抗糖蛋白，羊乳中特有的α-2-HS-糖蛋白等，此外还对成功鉴定的乳蛋白进行基因注释和功能差异分析比较，牛乳蛋白主要涉及抗氧化活性及细胞黏附等特有功能，而羊乳蛋白包括催化活性及与病毒反应等特有功能。因此牛羊乳中蛋白质等电点及分子量差异、特有低丰度蛋白种类以及鉴定成功的蛋白功能差异均可作为牛羊乳区别检测的靶点。