基于牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及关联化合物为特征指标羊乳掺假的分析研究

朱礼，吴海智，周丛，袁列江，徐正华，王淑霞，薛敏敏，陈兰煊，魏湘

（1.湖南省产商品质量检验研究院，长沙 410007；2.黄埔海关技术中心，广州 510000）

0 引言

乳作为人类健康膳食的主要营养来源，被认为是日常膳食中最天然、最有营养的食物之一[1]，由于乳制品含有蛋白质、脂肪、矿物质等对人体很有利的营养素，故作为多个国家居民膳食指南的重要推荐食品之一。羊乳因其独特的风味和营养价值而为多数消费者青睐[2]。近年来羊乳在国外应用广泛，我国的羊乳市场也在迅速上升，而由于羊乳的泌乳期因受季节气候波动和动物间个体差异等因素影响较大，使得产奶量不如牛乳，故价格高于牛乳，鲜羊乳在欧洲的零售价约是牛乳的7倍之高[3]，在我国则约是牛乳的4倍左右，故商家为降低成本，会在羊乳中混入牛乳以此来牟取利益[4-5]。但这样一种为了获取经济利益的掺假方式，不仅会导致产品质量不合格，而且损害了消费者的健康和权益[6]，特别是对牛乳过敏的人群，由于不恰当的标签标识，使该类人群易饮用了掺入牛乳的羊乳制品而过敏[7]。这种掺假不仅在液态羊乳及其制品中，更多的会出现在原料乳的收购过程中，因此需要建立一种适宜于企业和乳站快速检测羊乳中是否掺入牛乳的方法，以确保羊乳制品质量和安全[8]。

依据羊乳和牛乳化学组成上的差异，现有的检测方法多是以牛羊乳中蛋白质、脂肪、DNA、维生素等为特征指标进行检测[9-12]。牛磺酸分布于动物组织细胞内，具有保肝利胆、抗心律失常、预防心血管疾病和提高免疫力的生理作用，能够促进婴幼儿脑组织和智力发育[13-15]。肌醇是一种水溶性维生素，易溶于水，广泛存在于各种天然动物、植物及微生物组织中，能降低胆固醇、促进脂肪代谢等，并对脂肪肝、肝硬化、肥胖等疾病有治疗和预防作用[16]。磷酸腺苷及其关联化合物均是参与遗传信息储存、遗传与表达的核酸构件的生物活性因子，其含量水平与泌乳动物品种以及原料新鲜程度密切相关[17-19]。

本研究通过分析不同品种及地域的乳制品中不同生长因子的含量发现，纯牛羊乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物的含量均存在显著性差异。因此本研究利用纯羊乳跟纯牛乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物的差异性，通过建立的高效液相色谱和气相色谱技术对不同品种及地域的乳制品进行特征指标的分析，同时以这些特征指标的样品数据为基础，通过总结不同品种及地域的乳制品中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及关联化合物的含量的变化规律结合主成分分析（PCA），建立了一种基于牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及关联化合物作为特征指标牛羊乳初步筛查预判的分析方法。建立以牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及关联化合物为特征指标的评价方法可应用于羊乳的真伪鉴别。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品的采集

纯牛乳与纯羊乳均由各乳品企业提供，确保样品的真实性；鲜羊乳均在各牧场新鲜采集，冷链运输，确保样品的真实性与稳定性；羊乳掺假盲样验证样品均为市售。

1.1.2 试剂与材料

肌醇标准品（CAS号：87-89-8，纯度99.0%），上海安谱实验科技有限公司；牛磺酸标准品（CAS号：107-35-7，纯度99.9%），上海安谱实验科技有限公司；三磷酸腺苷标准品（CAS号：9000-83-3），纯度≥96%），上海安谱实验科技有限公司；二磷酸腺苷标准品（CAS号：58-64-0，纯度≥98%），上海安谱实验科技有限公司；环磷酸鸟苷标准品（CAS号：7665-99-8，纯度99%），上海安谱实验科技有限公司；叶黄素标准品（CAS号：127-40-2，纯度99%），美国Sigma有限公司；D-泛酸钙标准品（CAS号：137-08-6，纯度99%），美国Sigma有限公司；甲醇、乙腈（色谱纯)，国药集团化学试剂有限公司；三甲基氯硅烷（GC级，纯度≥99.0%），上海麦克林生化科技有限公司；六甲基二硅胺烷（分析纯，纯度98%），上海麦克林生化科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺、二水乙酸锌、亚铁氰化钾、无水乙醇、无水碳酸钠、硫酸钾、硼酸、磷酸二氢钠、氢氧化钠、高氯酸、磷酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钾、盐酸、氯化钠（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司；邻苯二甲醛（色谱纯），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；泛酸测定培养基，美国BD公司；植物乳杆菌（ATCC8014），美国BD公司；环己烷、乙醚、正己烷、无水乙醇、甲基叔丁基醚、二丁基羟基甲苯、甲苯（色谱纯），上海安谱实验科技有限公司；Brij-35（10%）、2-巯基乙醇、四丁基溴化铵，上海安谱实验科技有限公司。

1.1.3 仪器与设备

气相色谱仪（GC-2030型，配分流/不分流进样口、FID检测器），日本岛津科技有限公司；高效液相色谱仪（Agilent 1200，包括四元汞、脱气机、自动进样器、柱温箱、化学工作站、荧光检测器、二极管阵列检测器），美国安捷伦公司；石英毛细管柱（ZB-5ms型（15.0 m×0.25 mm×0.50μm）），北京艾杰尔科技有限公司；色谱柱（ZORBAX Eclipse-AAA（3.0×150 mm，3.5μm）），美国安捷伦公司；色谱柱（AQ-C18（4.6×250 mm，5μm）），美国安捷伦公司；生化培养箱（SPX-250B-Z型），上海博讯实业有限公司医疗设备厂；紫外-分光光度计（UV-2540），日本岛津科技有限公司；超纯水仪（ELIX3 Essential+Reference型），广东丹利科技有限公司；台式高速离心机（Allegra 25R），美国贝克曼库尔特有限公司；多通道平行浓缩仪（MV5型），莱伯泰科仪器股份有限公司；数显恒温水浴锅（HH.S11-2型），天津泰斯特仪器有限公司；电热鼓风干燥箱（DHG-9420A型），上海一恒科学仪器有限公司；涡旋混合器（美国Talboys EOFO-945007基本型），上海安谱实验科技股份有限公司；电子天平（Q224-1CN型），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；pH计，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；Multifuge X4 Pro冷冻型高速离心机，美国赛默飞世尔科技；超声波清洗器（KQ－250B型），昆山市超声仪器有限公司。

1.2 测定方法

1.2.1 牛磺酸测定方法

牛磺酸测定参考本课题组吴海智[20]等的方法，应用高效液相色谱仪，荧光检测器，色谱柱：ZORBAX Eclipse-AAA（3.0×150 mm，3.5μm）；流动相：流动相A：流动相B=85∶15；流速：0.5 mL/min；柱温：35℃；检测波长：激发波长：338 nm，发射波长：425 nm；进样量：1μL。

1.2.2 肌醇测定方法

肌醇测定参考本课题组朱礼[16]等的方法，应用气相色谱仪，氢火焰检测器（FID），色谱柱：ZB-5ms石英毛细管柱（15.0 m×0.25 mm×0.50μm）；进样口温度260℃；进样体积1.0μL，分流比5∶1；色谱柱流速1.48 mL/min；程序升温条件：120℃保持0 min，10℃/min升温至190℃，保持7 min，然后50℃/min升温至280℃，保持4.2 min，共20 min；检测器温度280℃；载气：高纯氮气，纯度≥99.999；高纯氢气，纯度≥99.999，流量30 mL/min；高纯空气，流量400 mL/min。

1.2.3 磷酸腺苷及其关联化合物测定方法

磷酸腺苷及其关联化合物测定参考沈丽[18]等的方法，应用高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 m，1.7μm）；流动相：流动相A：20 mmol/L磷酸钾缓冲液（含5 mmol/L四丁基溴化铵，pH=6.5），流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：35℃；检测波长：259 nm；进样量：2μL。

1.2.4 叶黄素测定方法

叶黄素测定参考食品安全国家标准方法[21]GB5009.248-2016，应用高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，色谱柱：CT99S05-2546WT C30（4.6 mm×250 m，5μm）；流动相：流动相A：甲醇/水（88+12，体积比，含0.1% BHT），流动相B：甲基叔丁基醚（含0.1% BHT）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：445 nm；进样量：50μL。

1.2.5 泛酸测定方法

泛酸测定参考食品安全国家标准方法[22]GB5009.210-2016第一法微生物法，应用生化培养箱，SPX-250B-Z型，36℃，20 h；紫外-分光光度计，UV-2540，540 nm；植物乳杆菌（ATCC8014）。

1.3 数据分析

按照1.2中的检测方法对不同品牌及地域的纯牛乳和纯羊乳进行牛磺酸、肌醇、磷酸腺苷及其关联化合物、叶黄素和泛酸含量的测定。对测定的数据进行检测含量及主成分分析（PCA），主成分分析（PCA）采用SPSS20.0处理。

2 结果与分析

2.1 不同品种及地域的纯牛羊乳制品中生长因子含量分析

选取由不同乳品企业提供的40个纯牛乳和40个纯羊乳真实样品，按照1.2中检测方法分别对5种生长因子牛磺酸、肌醇、磷酸腺苷及其关联化合物、叶黄素及泛酸的含量进行测定。纯牛羊乳中各生长因子含量检测结果见图1～5。由图1～3可知，牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种生长因子纯羊乳与纯牛乳分界明显，且含量均存在显著性差异。纯羊乳中牛磺酸的含量约为纯牛乳的9倍多；纯羊乳中肌醇的含量约为纯牛乳的4倍多；纯羊乳中磷酸腺苷及其关联化合物的含量最高值约为纯牛乳的10倍多。同时，由图4～5可知，纯牛羊乳中叶黄素与泛酸这两种生长因子含量差异不大。

图1 纯牛羊乳中牛磺酸检测结果箱线图

图2 纯牛羊乳中肌醇检测结果箱线图

图3 纯牛羊乳中磷酸腺苷及关联化合物检测结果箱线图

图4 纯牛羊乳中叶黄素检测结果箱线图

图5 纯牛羊乳中泛酸检测结果箱线图

2.2 不同品种及地域的纯牛羊乳制品中生长因子主成分分析（PCA）

PCA是一种通过降维的方法将多个变量转化成一组新的、互相无关的若干综合变量，且每个新的综合变量均能够反映原始变量信息的统计方法[23-24]。由于PCA是一种无监督的分析方法，有一定的局限性，一般仅用来观察实验样品的自然分布和组别关系[25]。本研究分别选取由不同乳品企业提供的40个纯牛乳和40个纯羊乳真实样品，按照1.2中检测方法分别对牛磺酸、肌醇、磷酸腺苷及其关联化合物、叶黄素和泛酸5种生长因子的含量进行测定。以80个纯牛羊乳制品五种生长因子牛磺酸、肌醇、磷酸腺苷及其关联化合物、叶黄素和泛酸的含量为变量，采用SPSS20.0软件进行主成分分析（PCA）。图6为不同品牌纯牛羊乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物、叶黄素和泛酸五种生长因子主成分分析（PCA）碎石图。由图可知，纯牛羊乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种生长因子的方差贡献率累积达到95.5%，能够反映纯牛羊乳制品的大部分信息，可以选取这3种生长因子作为特征指标进行进一步分析。图7为选取的80个纯牛羊乳制品3种特征指标牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物的PCA分析图，序号1～40号为纯牛乳，序号41～80号为纯羊乳。由图7可以看出，纯牛乳分布比较集中，纯羊乳分布较为分散，但纯羊乳与纯牛乳能够完全分开且分界线明显。

图6 纯牛羊乳中不同生长因子主成分分析（PCA）碎石图

图7 纯牛羊乳及羊乳盲样验证样品主成分分析（PCA）分析图

由此可知，通过采用1.2中检测方法对80个纯牛羊乳制品中牛磺酸、肌醇、磷酸腺苷及其关联化合物、叶黄素和泛酸的含量进行测定，发现纯牛羊乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种生长因子的含量均存在显著性差异。同时通过对5种生长因子进行主成分分析（PCA），通过主成分分析（PCA）碎石图发现纯牛羊乳中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种生长因子的方差贡献率累积达到95.5%，且从纯牛羊乳主成分分析（PCA）分析图可知，纯羊乳与纯牛乳能够完全分开且分界线明显。因此，可以选取牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物为特征指标对牛羊乳进行初步筛查预判。基于牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物为特征指标结合主成分分析（PCA）的评价方法可以应用于羊乳的真伪鉴别。

2.3 羊乳掺假盲样验证检测

为判定基于牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物为特征指标的评价方法可应用于羊乳的真伪鉴别，根据1.2中检测方法对市售的10种纯羊乳进行牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种特征指标进行盲样验证检测。市售纯羊乳盲样检测结果见表1。

表1 市售纯羊乳盲样中牛磺酸、肌醇和酸腺苷及其关联化合物含量测定结果

由表1可知，样品83和样品87中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种特征指标的含量测定结果均非常低且与纯羊乳制品含量存在显著差异，检测结果显著异常，由此判断这两个样品为可疑样品。样品90中牛磺酸和肌醇含量测定结果均比纯羊乳制品正常含量的测定值偏低且未检出磷酸腺苷及其关联化合物，检测结果也存在异常。

为判定本评价方法的准确性，将市售的10种纯羊乳的牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种特征指标进行主成分分析（PCA），分析结果如图7所示。由图可知，样品81、样品82、样品84～86、样品88～89均处于纯羊乳的分布区；样品83和样品87两个可疑样品均处于纯牛乳的分布区；样品90处于纯羊乳和纯牛乳分布区的中间位置，因此预判样品83和样品87两种羊乳为假冒产品，样品90纯羊乳中可能掺入了一定比例的纯牛乳。该结果与采用1.2中检测方法进行3种特征指标含量测定的结果推断一致，因此进一步证明了本评价方法的准确性可以应用于羊乳的真伪鉴别。

3 结论

本研究通过分析不同品种及地域的纯牛羊乳制品中不同生长因子牛磺酸、肌醇、磷酸腺苷及关联化合物、叶黄素和泛酸的含量发现，牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种生长因子含量存在显著性差异。选取牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及其关联化合物3种生长因子作为特征指标，通过建立的高效液相色谱和气相色谱技术对不同品种及地域的纯牛羊乳制品进行3种特征指标的含量分析，以这些特征指标的样品数据为基础，通过总结不同品种及地域的纯牛羊乳制品中牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及关联化合物含量的规律并结合主成分分析（PCA）方法，建立了一种基于牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及关联化合物作为特征指标羊乳掺假初步筛查预判的评价方法。通过盲样样品验证证实本评价方法准确性高，可应用于羊乳的真伪鉴别。基于牛磺酸、肌醇和磷酸腺苷及关联化合物作为特征指标羊乳掺假初步筛查预判的评价方法可为牛羊乳掺假技术的发展以及整个乳制品行业的安全发展提供技术支持，为进一步完善乳制品安全检测技术体系和保障乳制品市场的规范性提供参考。