响应面法优化混菌发酵肉鹅青贮饲料工艺研究

■裴朝东

（广西工商职业技术学院，广西南宁 530007）

近几年来，随着饲料原料价格的上涨，以玉米、豆粕为主要原料的配合饲料的成本大幅上升，对养殖户造成非常大的压力，并进一步压缩了养殖户的经济效益。越来越多的养殖企业将目光转向原料代替。其中，地缘性饲料（特别是青贮饲料）的使用，可提高饲料利用率，降低养殖成本，改善养殖动物品质，减少由养殖带来的环境压力，是近年来养殖业的主要发展趋势。青贮饲料作为牲畜的重要饲料之一，受到越来越多的业内人员关注和使用。特别是以嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌等为菌种，通过不同工艺发酵甜象草、甘蔗尾、构树叶、桑枝等地缘性饲料，具有重要的研究价值。研究发现，微生物饲料添加剂能有效改善青贮饲料的营养价值和饲料价值，其中乳酸菌能在厌氧环境下良好生长，青贮过程中添加嗜酸乳杆菌能抑制有害菌的生长、降低细胞的有氧消耗，从而减少青贮原料的养分损失、降低青贮饲料的pH 和氨态氮的含量[1]。高晓梅等[2]关于不同类型饲料原料混合发酵青贮象草品质的影响研究显示，在象草中添加不同类型饲料原料混合青贮象草，可有效降低青贮饲料的pH 和纤维含量。彭昱雯等[3]对酒糟发酵生物饲料的生产及其对动物生产性能的影响研究发现白酒糟富含丰富的营养物质，是青贮发酵饲料的理想原料。杨耀刚等[4]研究发现，乳酸菌对玉米秸秆等青贮原料具有良好的发酵作用。

基于以上研究情况，本试验以嗜酸乳杆菌活菌数为衡量指标，通过对组成产品的干白酒糟、稻壳、玉米粉和象草等4 种原料的组成含量进行分析，研究各因素对嗜酸乳杆菌活菌数的影响情况，为肉鹅养殖户根据实际生产条件进行混菌发酵青贮饲料提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

原料：稻壳（广西雄达米业有限公司）、干白酒糟（市售干白酒糟，常温下暂存3个月，简称酒糟）、玉米粉（广西马山县本地产玉米）、甜象草（简称象草，广西本地种植象草）。

菌粉：嗜酸乳杆菌（Lactobacilltus acidlophilus）（山东蔚蓝生物科技有限公司，含量10×108CFU/g）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）（山东蔚蓝生物科技有限公司，含量1 000×108CFU/g）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（山东蔚蓝生物科技有限公司，含量200×108个/g），以上3 种微生物组分，分别按30%、30%、40%混合，取500 g待用。

培养基及试剂：MRS 培养基，广东环凯微生物科技有限公司。

试验基地：广西马山县红益养殖公司；广西马山县乔利乡、丁当乡等肉鹅养殖户。

1.2 仪器与设备

万分之一电子天平（FA2004，上海舜宇恒平科学仪器有限公司，e=1 mg，d=0.1 mg）、电子天平（WT30002、杭州万特衡器有限公司，e=0.1 g，d=0.01 g）、电子水分测定仪（DHS-10A，宁波市鄞州华丰电子仪器厂）、生化培养箱（SPX-150，上海力辰邦西仪器科技有限公司）、脂肪测定仪（SZF-06A，上海精隆科学仪器有限公司）、自动定氮仪（K1100，济南海能仪器有限公司）、消化炉（SH220，济南海能仪器有限公司）。

1.3 测定指标与方法

试验主要测定混菌发酵青贮肉鹅饲料中嗜酸乳杆菌活菌数以及粗脂肪、粗蛋白含量等指标。其中嗜酸乳杆菌活菌数的含量按GB/T 20191—2006《饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验》的方法测定；pH按AACC（2000）的方法测定；水分含量按GB/T 6435—2014《饲料中水分的测定》方法测定；粗脂肪含量按GB/T 6433—2006《饲料粗脂肪的测定》方法测定；粗蛋白含量按GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定》（凯氏定氮法）方法测定。

2 试验方法

2.1 发酵工艺

试验模拟养殖基地或养殖户生产实际相似的发酵条件，全株新鲜象草经粉碎后，先与4%菌粉混合均匀，按顺序添加酒糟、玉米粉，再次混合均匀后，最后添加稻壳混合均匀，拉杆自封袋封装，压实或适当抽真空，密封，（36±1）℃发酵72 h以上。

2.2 试验设计

2.2.1 单因素选择及水平确定

根据前期试验，通过查阅相关文献，根据肉鹅营养需要，结合养殖基地、养殖户现实情况，以及嗜酸乳杆菌发酵优化条件的相关研究，模拟养殖基地或农户在一定的温度、一定水分范围、特定添加量、发酵青贮饲料与肉鹅配合饲料的成本对比、肉鹅在3～7周龄的营养需要量、嗜酸乳杆菌的发酵优化温度、水分条件等因素，选择酒糟、稻壳、玉米粉、象草等4 个因素为自变量因子。

根据GB/T 20191—2006《饲料中嗜酸乳杆菌的微生物学检验》要求，以及嗜酸乳杆菌高密度发酵条件的研究结果，将发酵温度设定为（36±1）℃[5-6]，接种量设定为4%。Box-Behnken 响应面试验的各因素和水平如表1所示。

表1 青贮肉鹅饲料优化设计因素及目标范围

2.2.2 Box-Behnken响应面试验设计方法确定

根据前期试验结果，不同组分发酵条件下，嗜酸乳杆菌的活菌数与组分之间的关系一般呈散点式，符合Design Expert 中的Box-Behnken 方法特征。故试验选用Design Expert 中的Box-Behnken优化方法。

2.3 数据统计与分析方法

数据首先用Excell 2010进行初步整理，然后再用Design Experts 13.0.1.0响应面（Response surface methodology，RSM）设计中的Ben-henken 设计方法，试验结果通过方差分析后，进行优化。

3 结果与分析

3.1 Box-Behnken响应面优化试验及结果分析

3.1.1 Box-Behnken响应面优化试验及结果

设嗜酸乳杆菌活菌数（R1）为响应值，采用Box-Behnken 响应面优化设计原理，考查稻壳（A）、酒糟（B）、玉米粉（C）和象草（D）4 个因素对嗜酸乳杆菌活菌数（R1）的影响。嗜酸乳杆菌活菌数响应面优试验设计及结果如表2所示。

表2 嗜酸乳杆菌活菌数响应面优试验设计及结果

试验同时监测样品的粗脂肪及粗蛋白含量等两个主要营养成分变化情况。发酵前后，各试验组主要粗脂肪、粗蛋白等两个主要营养成分指标变化如表3所示。

由表3 可知，与发酵前相比，各试验组发酵后粗脂肪、粗蛋白的含量均有不同程度的增加，其中粗脂肪的增幅度为1.34%～4.33%，粗蛋白的增幅3.50%～5.10%。

表3 各试验组粗脂肪、粗蛋白检测结果

3.1.2 嗜酸乳杆菌活菌数响应面优化试验回归模型及方差分析

将嗜酸乳杆菌活菌数（R1）响应面结果进行二次响应面回归分析，结果如表4所示。

由表4 中可知，项目的模型显著性检验（P=0.003 3＜0.05），表明该模型具有统计学意义。由表4知，其自变量一次项变量B、C、D、二次项AB、D2显著（P＜0.05）。失拟项（Lack of Fit 的P=0.577 5＞0.05）不显著，表明所用模型与试验拟合的差异，对模型是有利的，无失拟因素存在。因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。拟合统计结果如表5、表6所示。

表5 回归拟合统计

表6 回归方程系数表

通过Design Expert 13.0.1.0 软件进行二次响应面回归分析，得到多元二次响应面回归模型。

3.1.3 等高线和三维响应曲面图分析

各组分的交互作用对嗜乳杆菌活菌数所形成的等高线及响应面如图1～图6所示。

3.2 各组分优化及验证试验分析

3.2.1 组分响应面优化分析

由图1～图6所示可以看出，每个响应面三维分析图和对应的等高线图分别为当2个变量保持一定水平时，另2个独立变量之间的交互作用。由图1可见，A（稻壳）、B（酒糟）的交互作用显著（P=0.016 8＜0.05），说明它们之间对发酵后的嗜酸乳杆菌活菌数的影响并不是简单的线性关系；在一定范围内，随着A（稻壳）、B（酒糟）的增加，嗜酸乳杆菌活菌数随之增加，当达到最大值后，嗜酸乳杆菌活菌数有所下降；图2、表4 所示，也反映了AC（P=0.142 6）、CD（P=0.132 6）的交互作用对嗜酸乳杆菌活菌数的影响在一定范围内有所上升，但显著性不强。

表4 嗜酸乳杆菌活菌数（R1）响应面试验结果

在获得回归二次项模型和响应面之后，对已回归的二次项非线性模型方程求极值，可以得到曲面的最大点。对回归方程求解最大值可得优化结果如表7所示。

表7 嗜酸乳杆菌优化结果

当A=148.663，B=88.657，C=28.448，D=280.182，即当稻壳为148.663 g，干白酒糟为88.657 g，玉米粉为28.448 g，象草为280.182 g，在特定的温度条件下（36±1）℃，指定的添加量（4%），经过混合发酵72 h以上，嗜酸乳杆菌活菌数预测值为44.92×107CFU/g。

3.2.2 验证试验

按上述优化后的组分，每组3 个平行，接种量为4%，混合均匀后压实，密封，（36±1）℃发酵72 h后检验，得到嗜酸乳杆菌的活菌数为44.82×107CFU/g，与预测值的相对误差为0.22%，符合规定。

4 讨论

固态混菌发酵青贮饲料是一个复杂的过程。发酵过程中，微生物生长所需要的碳源、氮源是重要的条件。本试验反映了组分中稻壳、酒糟、玉米粉、香草等各组分对发酵产品中嗜酸乳杆菌活菌数的影响程度，其可能的影响机理包括以下几种。

①研究表明，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母在嗜酸乳杆菌发酵中，存在复杂的影响关系[7-8]。在一定条件下改变枯草芽孢杆菌、酿酒酵母的比例会引起嗜酸乳杆菌活菌数的变化，但本试验所接种的复合菌中，嗜酸乳杆菌、酿酒酵母的含量已确定。在真空或密封袋装状态下，枯草芽孢杆菌繁殖过程会促进嗜酸乳杆菌的扩繁，同时，一定条件下，酿酒酵母也会促进嗜酸乳杆菌的扩繁，但只要不改变接种量，一般情况下不会影响总体的活菌数，其影响机理有待进一步研究。

②本试验中，引起嗜酸乳杆菌大量扩繁的碳源和氮源来源，主要考虑来自3个方面，一是酒糟，二是玉米粉，三是象草。研究表明，干白酒糟主要是以高粱、玉米和大麦等谷物为主要原料，以谷壳为发酵填充通过固态发酵和蒸馏形成[9-10]，干白酒糟的主要成分为粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）、淀粉和多糖[11]；玉米粉是青贮饲料发酵的一般营养物质，为青贮饲料的发酵提供氮源和碳源；而新鲜的象草，具有丰富的营养物质，向白菊等[12]研究表明，新鲜象草的含糖量大于4%。

③本试验中，没有对水分进行优化处理，一方面考虑在实际发酵过程中，养殖基地对水分的控制并不精准；另一方面，新鲜象草的含水量高达75%～80%。本试验中发酵所需要的水分含量，可直接由鲜象草本身提供，不需要额外添加水分；有关水分的另一不稳定因素在于新收割的象草，需要尽快粉碎发酵，以免水分和糖分损失，影响发酵效果。

④本试验对混合工艺有一定的要求，混合是否均匀、粉碎粒度大小等，均影响发酵的时间和品质。前期试验显示，先将菌粉与粉碎后的鲜象草进行混合后，再按顺序混合其他原料，一方面保证菌粉分布均匀，另一方面，可让接种的菌粉快速繁殖，进一步提高发酵质量。

⑤各组样品在发酵前后，其主要营养指标（粗脂肪、粗蛋白）等均有一定程度的增加，但增加幅度均不大，其可能原因在于有益菌在发酵扩繁过程中，能产生少量的营养物质，具体机理有待进一步研究。

5 结论

模拟肉鹅养殖基地或养殖户实际生产条件，采用响应面法优化设计，探索指定添加量、指定发酵温度条件下，筛选出以稻壳、酒糟、玉米粉、象草等因素中对嗜酸乳杆菌活菌数的显著影响因素，并通过响应面优化法，找到最优组成成分。优化后的组分为稻壳为148.663 g，干白酒糟为88.657 g，玉米粉为28.448 g，象草为280.182 g，接种量为4%，发酵温度为（36±1）℃，发酵72 h后，可得嗜酸乳杆菌的最大活菌数为44.92×107CFU/g。为养殖基地或养殖户在养殖过程中进行简易快速发酵肉鹅青贮饲料提供参考依据。

综上所述，本研究可为肉鹅养殖户利用象草等地缘性饲料进行青贮发酵提供参考依据和参数借鉴。