沙枣叶提取物体外抗菌、抗氧化活性研究

■德勒黑 杨 斌 萨茹丽* 钱琳娜 陈乐祥 吴苏日古嘎

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古自治区农牧业科学院兽医研究所，内蒙古呼和浩特 010031；3.通辽市畜牧业发展中心，内蒙古通辽 028000）

随着现代科技、医学技术的发展，研究人员逐渐发现了沙枣叶具有清热解毒、抗菌消炎、活血化瘀的药用价值。目前，世界上一共有90多种沙枣，广泛生长在亚洲、欧洲和北美地区[1]。沙枣树也叫桂香柳，生长于内蒙古自治区西部沙漠里，是一种抗旱、抗寒能力极强的沙生植物。在现代园林绿化中沙枣也具有一定的生态和经济效益，可用于防风固林、美化环境和防止侵蚀[2]。许多植物的果实、花、种子和叶子中含有酚类化合物和黄酮类化合物等天然来源的活性化合物，由于它们能够释放电子和清除自由基，因此具有抗氧化活性[1]。有关研究报道，沙枣水提物可有效降低四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的血糖水平[3]。近年来，由于抗生素耐药微生物引起的疾病发生率增加，利用具有天然抗菌活性的药用植物的研究呈高增长势头[4]。沙枣果实提取物中含有类黄酮化合物、多糖、谷甾醇、萜类、香豆素、酚羧酸、氨基酸、皂苷、类胡萝卜素、维生素和单宁[5-7]。Liu 等[8]发现金丝小枣酚酸类化合物的主要成分为原儿茶酸、儿茶酚、对羟基苯甲酸、香草酸和对香豆酸，其含量分别为17.02、5.87、7.46、2.95、1.06 mg/g。研究表明，摄入具有抗氧化特性的膳食抗氧化剂、水果或蔬菜，可提高生活质量，延缓衰老及降低退行性疾病的发生[9]。目前国内外学者对于植物提取物抗菌及抗氧化等方面的研究较多，但沙枣叶及其提取物的抗菌、抗氧化研究较少。本试验通过对沙枣叶提取物的体外抗氧化以及抗菌作用进行研究，综合评价沙枣叶提取物体外抗菌、抗氧化活性，以期为沙枣叶的综合开发利用提供实际应用依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

沙枣叶：采摘自内蒙古呼和浩特市托克托县永胜域村。

菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、白葡萄球菌（Staphylococcus albus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、马链球菌（Stretpococcus equi），由内蒙古自治区农牧业科院兽医研究所实验室提供。滤菌膜、移液器、移液管、一次性注射器、牛津杯（45～50个）、小烧杯50 mL×10个。

1.2 试验试剂及仪器

试剂：总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（ABTS法）、1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH）清除能力试剂盒、羟自由基测定试剂盒、抑制与产生超氧阴离子（·O2-）试剂盒，以上所有试剂盒均购买自南京建成生物工程研究所有限公司。

药物：生理盐水、血清（孕马血清）、青霉素、氯化钠（NaCl）（天津市福晨化学试剂有限公司）；胰蛋白胨Tryptone（英国）、酵母提取物Yeast Extract（法国）、无水乙醇（天津市登科化学试剂有限公司）、琼脂Agar（英国）等。

试验仪器：全自动酶标仪（美国BIOTEK 公司的Synergy-HT型）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、移液枪（大龙医疗设备有限公司）、96孔酶标板、循环水式真空泵、全温双层振荡培养箱（金坛市盛蓝仪器制造有限公司）、SW-CJ-1F超净工作台（苏州广源净化工程有限公司）

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理

沙枣叶水提取物的制备：首先将沙枣叶低温烘干，之后进行粉碎处理，然后将粉碎的沙枣叶分装为300 g/包，每包锅中加入5～10倍纯化水煮3次，每次大火煮1 h，再将经煮3 次的沙枣叶水提物合并过滤浓缩至300 mL，得浓度为1 g/mL 原液。用纯化水将沙枣叶水提物原液（1 g/mL）依次稀释为500、333、250、200、100、50、20、10 mg/mL浓度的待测液。

沙枣叶乙醇提取物的制备：称取经粉碎沙枣叶120 g置于3 000 mL烧杯中，加入2 400 mL 70%乙醇（720 mL纯化水+1 680 mL无水乙醇）混匀后置于恒温振荡培养箱内60 ℃下微摇2 h，使用旋转蒸发仪浓缩至120 mL，得浓度为1 g/mL的沙枣叶醇提物原液，原液-20 ℃冰箱保存。临用前使用70%无水乙醇将沙枣叶醇提物原液（1 g/mL）稀释成浓度为500、333、250、200、100、50、20、10 mg/mL的待测液。

1.3.2 抑菌活性的测定

抑菌活性的强弱通过抑菌圈直径的大小表示，直径越大抑菌能力越强，反之越弱。先将7～8 mL 固体培养基（LA）均匀倒入培养皿中，凝固后用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，在水平放置的平皿中放置3只牛津杯，其间距相等，在小烧杯中倒入30 mL固体培养基再接种200 μL 菌悬液并摇晃均匀，再倒进培养皿，待培养基凝固后，取出放置的牛津杯，吸取试验药物溶液150 μL 至牛津杯孔中，在37 ℃恒温培养箱内培养16～18 h。青霉素作为阳性对照组，无水乙醇为空白对照组，16～18 h后观察是否有抑菌效果，并用游标卡尺测量抑菌圈直径（mm）。测量3个抑菌圈直径，结果以3次的平均值进行计算。抑菌效果判定：抑菌圈直径≤8 mm为不敏感；抑菌圈直径8～13 mm为低度敏感；抑菌圈直径13～19 mm为中度敏感；抑菌圈直径＞19 mm为高度敏感[10]；“-”为无抑菌活性。

1.3.3 体外抗氧化活性的测定

沙枣叶提取物体外总抗氧化能力（T-AOC）、清除DPPH自由基的能力以及羟自由基清除能力和抑制超氧阴离子自由基的测定方法按照南京建成生物工程研究所有限公司所提供的试剂盒说明书进行。

1.4 数据统计分析

试验数据均使用Excel制作成表格初步作图整理后，采用SAS9.2 软件进行方差分析，P＜0.05 视为差异显著，P＞0.05 视为差异不显著，数据为“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 沙枣叶提取物体外抑菌活性（见表1）

从表1数据可知，在试验中1 g/mL 浓度沙枣叶醇提物对大肠杆菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、马链球菌等5种菌的抑菌能力均为中度敏感（抑菌圈直径13～19 mm），对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌为低度敏感（抑菌圈直径8～13 mm）。500 mg/mL浓度沙枣叶醇提物对大肠杆菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌中度敏感，对枯草芽孢杆菌和马链球菌为低度敏感。333 mg/mL浓度沙枣叶醇提物对大肠杆菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌为中度敏感，对枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及马链球菌为低度敏感。250 mg/mL浓度沙枣叶醇提物对大肠杆菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌及金黄色葡萄球菌为中度敏感，对变形杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及马链球菌为低度敏感。200 mg/mL 浓度的沙枣叶醇提物对大肠杆菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌及变形杆菌为低度敏感，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及马链球菌为不敏感（抑菌圈直径≤8 mm）。100、50、20、10 mg/mL 浓度的沙枣叶醇提物对上述8种菌均为不敏感或无抑菌活性。沙枣叶水提物各浓度样品对上述8种菌均为不敏感（抑菌圈直径≤8 mm）或无抑菌活性。

表1 不同浓度沙枣叶提取物对8种菌的抑菌圈直径(mm)

2.2 沙枣叶提取物体外总抗氧化能力（见表2）

表2 沙枣叶提取物总抗氧化能力

从表2可知，沙枣叶提取物总抗氧化能力对比空白对照组差异显著（P＜0.05），沙枣叶水提物与醇提物之间差异不显著（P＞0.05）。沙枣叶水提物的总抗氧化能力高于空白对照组和沙枣叶醇提物。

2.3 沙枣叶提取物体外清除DPPH自由基的能力（见表3）

表3 沙枣叶提取物DPPH自由基清除能力(μg Tro lox/g)

从表3 可知，沙枣叶提取物浓度由原液（1 g/mL）至测定100 倍（10 mg/mL）稀释浓度，DPPH 自由基清除能力呈下降趋势。沙枣叶水提物1 g/mL 组和500 mg/mL 组清除DPPH 自由基能力高于醇提物1 g/mL 组和500 mg/mL 组，二者之间差异显著（P＜0.05）。沙枣叶水提物、醇提物原液（1 g/mL）和2 倍（500 mg/mL）浓度的清除能力高于其他稀释倍数的清除能力，沙枣叶提取物原液（1 g/mL）的清除能力显著其他测定组（P＜0.05），随着测定样品稀释浓度的下降，清除能力呈不同程度降低。

2.4 沙枣叶提取物对羟自由基的抑制作用（见图1）

图1 可以看出，沙枣叶醇提物原液（1 g/mL）到100 mg/mL 浓度的抑制率具有缓慢上升趋势，到达100 mg/mL浓度后迅速下降。沙枣叶水提物从1 g/mL浓度到200 mg/mL 浓度抑制率迅速上升，200 mg/mL开始其上升趋势平缓，且其抑制率随其浓度的下降而提高。在100 mg/mL浓度以下，沙枣叶醇提物对抑制羟自由基能力明显弱于水提物。

2.5 沙枣叶提取物对超氧阴离子自由基的抑制作用（见图2）

如图2 所示，沙枣叶醇提物随着其浓度降低，其抑制率也跟着缓慢下降，从不同提取物及不同浓度组间的比较可以看出，醇提1 g/mL、500 mg/mL浓度的抑制率显著高于其他浓度组（P＜0.05）。在不同提取物同浓度比较时，100 mg/mL、50 mg/mL、20 mg/mL 浓度抑制率差异不显著（P＞0.05）。与水提物各浓度组相比，醇提物各浓度抑制率稍强，醇提物抑制率随着浓度下降更为陡峭。沙枣叶醇提物对超氧阴离子自由基具有明显抑制能力且表现出一定的剂量效应关系。

3 讨论

3.1 沙枣叶提取物体外抗菌活性

近年来，随着饲料禁抗时代的到来，将寻找天然抗生素替代品的研究逐步推向了高潮。近些年对于天然植物提取物的抗菌活性研究非常广泛，也取得了一定的研究成果。家畜日粮中添加适量的植物提取物可以提高动物免疫力[11]。大量的研究表明，天然植物提取物中的生物活性成分具有抗菌功效，在谢永华等[12]榄绿粗叶木水提物体外抗菌效果的初步探讨试验中，发现榄绿粗叶木水提物对金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌高度敏感，对枯草芽孢杆菌中度敏感，对铜绿假单胞菌低敏感，而对大肠杆菌无抑制效果。Singh 等[13]研究发现粗茎老鹳草根的乙醇提物和乙醚提物对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原体均具有显著的抗菌作用。Tran 等[14]研究发现金银花和四角枫甲醇提取物对大肠杆菌、嗜水气单胞菌和无乳链球菌3 种菌具有显著的抗菌活性。吴小诗等[15]的诃子水提物体内外抗菌作用及止痒效果研究试验结果表明，水提物对马拉色菌感染模型具有良好的治疗作用，有望成为抗菌止痒且温和的去屑止痒产品的有效活性成分。沙枣作为西北部地区特有的沙生植物，其抗菌作用也逐渐被人们发觉。本次试验中1 g/mL、500 mg/mL、333 mg/mL、250 mL、200 mL 浓度沙枣叶醇提物对大肠杆菌、白葡萄球菌、绿脓杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌具有一定的抗菌作用，其他浓度沙枣叶醇提物对上述8 种菌不敏感或无抗菌活性，其抗菌活性与其醇提物浓度和受试菌菌种类型有关。沙枣叶水提物各浓度样品对上述8 种菌均为不敏感或无抑菌活性。买买提吐尔·克力木等[16]选用新疆沙枣水提液和浓缩物研究其抗菌活性，得出沙枣水提取物对受试菌无显著抗菌活性，对福式痢疾杆菌有微弱的抗菌效果。从结果中可以看出，随着水提物浓度的降低，其对一些受试菌的抗菌效果逐渐提高。因此推断沙枣叶水提物的抗菌活性可能与其受试菌种及浓度有关，后续可以从沙枣叶其他活性成分作为研究对象更加深入地研究其抗菌活性。

3.2 沙枣叶提取物体外抗氧化活性

畜禽机体产生过多的自由基会对其细胞功能有所损坏，从而导致动物生产性能下降。植物提取物可清除有害自由基，增强机体抗氧化能力，有效预防氧化应激造成的机体损伤[17]。抗氧化剂的化学结构多样，作用机制各不相同，其关键机制是抗氧化剂与自由基反应形成相对稳定的非活性产物[18]。Hamidpour 等[19]研究沙枣乙酸乙酯提取物的抗氧化和抗肿瘤活性，随着各样品浓度和极性水平的增加，其抗氧化能力逐渐提高了。冯涛等[20]使用超声波和离心结合的方法，以沙枣果实为材料，用70%乙醇提取的沙枣果肉对羟基自由基和过氧化物自由基的清除效果最好，其中羟基自由基的清除率更是高于河北枣和维生素E。本试验中沙枣叶醇提物清除羟自由基能力及抑制超氧阴离子能力的结果与其一致，因此推断，沙枣叶提取物体外抗氧化活性与其浓度呈剂量效应关系。研究发现沙枣叶乙醇提取物可通过调整体内的氧化与抗氧化系统，降低白细胞介素-4（IL-4）及免疫球蛋白E（IgE）的含量、升高γ干扰素（IFN-γ）的含量，调节Th1细胞/Th2 细胞免疫平衡而改善哮喘模型小鼠气道炎症[21]。本试验研究发现，高浓度沙枣叶醇提物抗氧化活性良好，总抗氧化能力及清除DPPH自由基能力沙枣叶水提物各浓度略高于醇提物，但在清除羟自由基能力及抑制超氧阴离子能力测定结果中沙枣叶醇提物显著高于水提物。在后期的研究中需向沙枣叶醇提物方面进行更加深入的研究，进一步开发沙枣叶生物活性功能，有利于其饲料添加剂潜力的开发，为现代畜牧业做出新贡献。

4 结论

①沙枣叶醇提物具有良好的抗菌活性，且其抗菌活性与其醇提物浓度和受试菌菌种类型有关，而沙枣叶水提物均无显著的抗菌活性。

②沙枣叶提取物具有一定的总还原能力、清除羟自由基、清除DPPH有机自由基能力以及抑制超氧阴离子自由基能力，其清除能力与其浓度呈剂量效应关系。